基因功能缺失技术及研究现状
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇基因功能缺失技术及研究现状范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：基因功能缺失是目前研究基因功能最重要、最有效的手段之一。目前应用比较广泛的基因功能缺失技术主要有反义RNA技术、RNA干扰技术、ZFN技术、TALEN技术、CRISPR-Cas系统等。这些技术通过抑制或者沉默特定基因的表达，研究生物体相关表型变化，推测该基因的相关功能。在实际研究中，基因功能缺失往往和基因过量表达一起，为基因的功能研究提供最直接的证据，在生物、医学、农业等领域得到广泛应用。本研究系统介绍了几种常用的基因功能缺失技术的发展历程、技术原理及应用等，并展望未来的研究和应用。
关键词：反义RNA；RNA干扰；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系统
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1405-08
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.08.002
Research Progress on Loss of Gene Function Technologies
NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b
（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.
Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases
20世o50年代DNA双螺旋结构的发现，标志着人们对生命科学的研究进入了分子生物学时代。随着后基因组时代的到来，基因组学的研究重心从揭示生命的所有遗传信息结构、组成等转移到对功能的研究上。除了传统的转基因（基因过量表达）外，定向抑制或完全消除特定基因的表达也是目前研究基因生物学功能的重要手段。因此，出现了反义RNA、RNA干扰等技术。随着研究技术手段的发展，近年来又兴起了ZFN技术、TALEN技术、CRISPR-Cas系统等基因功能修饰技术。这些技术不断被发现及应用，极大地促进了生物学研究的发展。本研究主要对基因功能缺失技术发展历程、技术原理及应用等方面进行概述。
1 反义RNA技术
反义RNA是指与靶RNA（多为mRNA）具有互补序列的RNA分子，它通过与靶RNA进行碱基互补配对的结合方式影响mRNA的后续翻译过程。反义RNA最早在原核生物E.coli的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现[1]。随后发现在真核生物中也存在天然的反义RNA，特别是发现了人工构建的反义寡核苷酸在真核生物中具有生物学效应以来，反义RNA技术已成为一种直接有效的人为控制基因表达的方法，并且倍受生物学界关注。
1.1 反义RNA作用机理
反义RNA主要通过与靶RNA以碱基互补配对的方式结合，参与基因表达调控。其作用机理为：①在DNA复制水平上。反义RNA通过与DNA复制时的起始引物RNA结合，阻止RNA引物与模板DNA的结合，抑制DNA的复制。②在转录水平上。反义RNA可以直接与mRNA5′端互补，阻止转录。③在翻译水平上。反义RNA通过与mRNA上的特定序列互补配对而结合。结合位置包括起始密码子AUG、靶mRNA的非编码区、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，从而直接或间接地抑制mRNA的翻译[2]。
1.2 反义RNA技术的应用
目前，反义RNA技术作为一种重要的基因调控手段，在植物、病毒、细菌中得到广泛应用。在植物中最显著的应用是果实成熟的控制。科学家通过控制乙烯合成途径中的关键酶来限制乙烯的合成，从而达到控制果实成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反义RNA技术抑制ACC合成酶的活性，使果实内的乙烯含量被抑制了99.5%。这为果实的贮藏、加工、运输等提供了新方法。
反义RNA技术在植物抗病方面也得到了很好的应用。植物病毒是影响植物生长的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在复制和表达的过程中都要经历RNA生物合成阶段，这为利用反义RNA技术进行抗病毒研究提供了理论依据。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作为目的基因，成功构建了反义基因并获得了表达反义基因的转基因烟草植株。试验结果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染症状大量减少甚至消失，并且该抗病毒性状可稳定遗传。
由于抗生素的滥用，细菌的耐药性越来越强。为了能够快速、简便获得新的抗菌药物，反义RNA技术被应用到药物筛选模型上。2006年科学家在金黄色葡萄球菌体内诱导表达出了针对单功能脂肪酸合成酶FabF的反义RNA，并构建了反义工程菌。研究发现，构建的反义工程菌对FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特异性抑制剂非常敏感，通过药物筛选获得了能够有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反义RNA技术寻找新型抗生素解决细菌耐药性的问题。
1.3 反义RNA技术的优缺点
随着研究的不断深入，人们对反义RNA技术也有了比较成熟的认识。与传统的基因敲除技术相比，反义RNA技术具有许多的优越性。①反义RNA技术操作较简单，适用范围广泛。通过靶mRNA的序列就可以合成所需的反义RNA，可用多个反义RNA同时阻断多个基因的表达。②特异性强[7]。反义RNA技术可以有选择性的迅速抑制目的基因的表达。该技术不会对蛋白质产生完全抑制，从而能避免致死突变，对细胞的正常生长影响较小。③安全性高[8]。导入细胞的反义RNA不能被翻译产生蛋白质，因此该技术在基因工程上的应用具有很大的安全性。
众多的因素限制了反义RNA的发展。主要包括：①成本较高。②靶基因定位困难。由于高等生物的基因组复杂，对特殊基因的靶向定位很困难。③使用效率问题。反义RNA的碱基序列、含量、靶序列结合部位和浓度等都会影响其使用效率[9]。
2 RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指与靶mRNA存在同源互补序列的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在细胞内特异性地降解靶mRNA的一种基因转录后沉默现象[10]。这一现象在自然界中广泛存在，是生物体在进化过程中形成的一种进化上保守的用来抵御外来基因或外来病毒侵犯的防御机制。
1990年Napoli等[11]将查尔酮合成酶CHS基因转入到牵牛花中，试图获得开出深紫色花朵的牵牛花，结果却得到了白色和斑片状花朵，即转入的CHS基因和与该基因同源的色素基因的表达均受到抑制，将这种现象称为转录后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分别将外源基因albino-1和albino-3转入粗糙脉孢菌（Neurospora）中，也出现了与植物共抑制相同的转录后基因沉默现象，将其称为基因压制（Gene quelling）现象。1995年Guo等[13]发现将秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正义链RNA和反义链RNA分别注射到线虫体内均会抑制par-1基因的表达，但当时的理论无法解释这一现象。直到1998年Fire等[10]才解释了这一现象，即RNAi是由于dsRNA引起的转录后序列特异性基因沉默，并将其命名为基因沉默（Gene silencing）。
2.1 RNA干_作用机理
RNA干扰作用机理可分为3个过程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。细胞质中的内源性或外源性的长dsRNA首先与Dicer酶结合，形成Dicer-dsRNA复合物，在Dicer酶的RNase的作用下，长dsRNA被特异性地裂解为21～23 nt siRNA。其5′端为磷酸基，3′端为羟基且含有2个突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解链，形成正义链和反义链，其中的反义链可指导形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）[15]。在siRNA的引导下，RISC通过碱基互补配对的方式识别具有同源序列的靶mRNA并进行剪切，其剪切位点为与siRNA反义链互补的第1个核苷酸下游的11或12个核苷酸处，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA为模板，siRNA为引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又产生新的siRNA，如此循环多次，可以使RNAi的作用进一步放大。因此，少量的siRNA可以产生高效的基因沉默效应[16]。研究还发现siRNA除了能导致转录后基因沉默，还可指导DNA甲基化酶与DNA的特定部位结合，引发该特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，导致转录水平的基因沉默[17]。
2.2 RNA干扰技术的应用
虽然人们对RNA干扰的研究只有短短的十几年时间，但发展却极为迅速，在生物医学等领域得到广泛应用。①疾病治疗上的应用。RNA干扰作为一种基因敲除技术，在肿瘤、病毒感染、遗传病治疗方面得到了广泛应用。An等[18]利用RNA干扰技术构建了卵巢癌OVCAR3细胞IGF-IR基因的siRNA表达质粒，通过脂质体法转染到人的卵巢癌OVCAR3细胞中，研究发现IGF-IR基因的siRNA能显著抑制其mRNA及蛋白质的表达，并且还能抑制OVCAR3细胞的增殖。RNA干扰技术为疾病在基因领域的治疗提供了新方法。②作为基因研究的新工具。由于RNA干扰能特异性的抑制目的基因的表达，根据其表型等的改变可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一种有效的手段[19]。Yu等[20]通过构建cyclin D1基因的siRNA表达质粒，研究cyclin D1基因对疤痕疙瘩成纤维细胞的细胞增殖和细胞周期的变化。③RNA干扰技术还被广泛应用于信号传导通路的研究。通过和传统的缺失突变技术结合，RNA干扰技术可以很容易确定复杂信号传导途径中不同基因的上下游关系[21]。Jin等[22]利用RNAi技术发现argonaute-1在FMRP参与神经元发育和突触生长过程中起重要作用，证明FMRP能调节信号通路。④药物的开发与应用。RNA干扰可作为寻找和鉴定新药物靶标的工具。利用RNA干扰技术可以明显缩短从鉴定到认识药物靶基因功能的时间，有助于药物开发过程中对已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干扰技术能降低蛋白转移酶9（PCSK9）的表达量，研究发现PCSK9表达量的降低能明显降低小鼠血清胆固醇水平，说明沉默PCSK9可成为治疗高胆固醇的药物靶点。
2.3 RNA干扰技术的优缺点
RNA干扰技术具有以下特点：①高效性。RNAi存在级联放大效应。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA为模板可以产生新的siRNA，如此循环多次，可以使RNA干扰的作用进一步放大。因此，少量的siRNA可以产生高效的基因沉默效应。②特异性。siRNA与靶mRNA通过碱基互补配对原则进行结合，只特异性的诱导靶mRNA的降解。研究表明，即使是一个碱基的错配，也会影响靶mRNA沉默效率[25]。对mRNA前体几乎没有影响，以内含子或启动子构成的dsRNA也不产生RNA干扰现象。③可传播和可遗传性。RNA干扰效应可以在不同细胞间进行传递，并且可以传递到下一代。Fire等[10]通过将dsRNA注射到线虫体内，发现dsRNA可以扩散到其他细胞中，并且在下一代也表现出了RNA干扰现象。
目前，对RNA干扰的研究仍处于初级阶段，还有许多问题亟待解决。主要包括：①存在脱靶现象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特异性沉默或表达上调，抑制细胞的正常生长。②稳定性差。siRNA导入受体细胞后RNA干扰效应持续数天后便会消失。③载体的安全性问题。在临床应用上，载体作为外来抗原可激活机体的免疫应答，使载体失活，甚至可能对机体造成严重的不良后果[26]。
3 锌指核酸酶（ZFN）技术
1983年，锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾转录因子IIIA中被发现。随着研究的不断深入，人们对ZFP有了进一步的了解。1996年Kim等[27]将锌指结构域与IIs型限制性核酸内切酶FokⅠ的切割结构域融合，获得了具有识别特性的人工合成的核酸内切酶。随后，Bibikova等[28]利用ZFN技术对爪蟾的卵母细胞开展外源DNA修复试验，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技术成功敲除了果蝇的一个内源基因。ZFN技术的应用实现了对基因的高效定点修饰，对研究基因的功能具有重要意义。
3.1 ZFN的结构及作用机理
ZFN是由锌指蛋白（ZFP）结构域和核酸内切酶（FokⅠ）的切割结构域两部分组成[27]。ZFP结构域主要负责识别并特异结合靶DNA序列。FokⅠ的切割结构域主要负责切割靶DNA。
ZFP结构域一般是由3～6个Cys2-His2型的锌指结构域串联组成，多个锌指结构的串联不仅可识别较长的靶DNA序列，还可以增加其修饰的特异性。每个锌指折叠成α-β-β（C端-N端）型的二级结构[30]，其中的α螺旋可插入到DNA双螺旋的大沟，α螺旋中的-1～+6位的7个氨基酸残基（+4位通常为亮氨酸残基）决定了对靶DNA识别的特异性[31]。每个锌指蛋白可识别并结合一个三联体密码（图1a）[32]。
FokⅠ是海床黄杆菌（Flavobacterium okeanokoites）表达的一种限制性内切酶，通过与ZFP的C端融合形成ZFN单体。FokⅠ的切割结构域必须形成二聚体才能发挥内切酶活性[33]。因此，在切割靶位点时，2个ZFN单体按照一定的距离和方向同各自的靶DNA链特异结合，2个FokⅠ切割结构域恰好可形成有活性的二聚体，在2个结合位点的间隔区（Spacer，通常为5～7 bp）切割DNA产生DSB切口。细胞再通过非同源性末端接合（NHEJ）或同源重组（HR）等方式对基因进行修复，改变靶DNA序列，从而达到基因敲除的目的[34]（图1b）。构建能特异性识别靶DNA的ZFP结构域是ZFN技术的关键。因此，只需根据目的基因设计出锌指结构域，再与FokⅠ融合形成ZFNs。然后将融合的ZFNs通^电穿孔、转染及病毒运输等方式导入细胞核中完成对靶基因敲除。
3.2 ZFN技术的应用
ZFN作为一种靶向修饰技术，可以精确地修饰基因及其周围调控元件，在生物体基因组改造与基因功能研究等方面得到广泛应用。ZFN已经成功应用于线虫、大鼠、小鼠、中国仓鼠、果蝇、海胆、斑马鱼、家蚕、植物、猪及人类iPS细胞和ES细胞中[35]。主要包括以下两方面：①对动植物基因组的靶向修饰。Bibikova等[29]利用ZFN技术对果蝇X性染色体的yellow基因进行定点修饰，结果发现50%的雄性果蝇发生颜色的改变。Zhang等[36]设计了针对敲除拟南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通过雌激素诱导启动子表达，研究发现T1代分别有7%和16%的植物含有体细胞突变，并且能稳定遗传给后代。②疾病的治疗。Li等[37]利用ZFN技术治愈了血友病B型小鼠，这为以后利用ZFN技术治疗基因疾病提供了新的有效手段。
3.3 ZFN技术的优缺点
ZFN作为第一代人工核酸内切酶技术，打破了只能通过同源重组的方式对基因组进行改造的观念。ZFN技术的优点包括：①与传统的方法相比较，ZFN技术提高了基因组的编辑效率，操作简单，可以快速敲除目的基因。②能够广泛地应用于各种生物，并诱导靶位点进行定点突变。
ZFN技术也存在着许多的局限性：①存在脱靶现象。由于ZFN对靶位点进行切割时容易脱靶，导致细胞代谢紊乱，从而对细胞产生毒副作用。②存在上下文依赖效应[38]。ZFN在识别靶DNA位点时，识别靶DNA的重复氨基酸之间会相互作用，导致识别的特异性发生改变，即识别靶DNA的特异性不高，影响基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特异性不高，很难设计出高特异性的锌指组合，目前该技术一直被生物公司垄断。
4 转录激活子样效应物核酸酶（TALEN）技术
1989年一类可以使植物患病的转录激活子样效应蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黄单胞杆菌（Xanthomonas）中分离得到[39]。2007年Kay等[40]发现一种TALE蛋白（AvrBs3）可以被黄单胞杆菌注入到宿主细胞内，然后进入宿主细胞核，与宿主upa20基因的启动子结合，激活宿主upa20基因的表达。2009年Moscou等[41]发现了TALE蛋白特异结合宿主基因启动子的机制。随着对TALE蛋白的深入了解，科学家发现TALE蛋白可以补足第一代人工合成的核酸内切酶（ZFN）技术的许多缺陷。2010年Christian等[42]首次报道了人工构建的TALEN技术。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重复序列进行了类似的试验，发现FokⅠ结构域连接到TALE结构域的C端的切割效果好于连接到N端。2012年Deng等[44]通过解析TALE蛋白的晶体结构，清晰揭示了TALE蛋白结合DNA的作用机制，为以后更好改造和应用TALEN打下了基础。
4.1 TALEN的结构及作用机理
TALEN是由TALE结构域和核酸内切酶（FokⅠ）的切割结构域两部分组成[45]。与ZFN技术原理类似，TALE结构域主要负责识别并特异结合靶DNA序列，FokⅠ的切割结构域主要负责切割靶DNA。
TALE蛋白是由N端的具有分泌信号功能的易位结构域（Translocation domain，TD）、中部DNA特异识别结合域、C端核定位信号（Nuclear localization signal，NLS）和转录激活结构域（Activation domain，AD）4部分构成。其中，中部DNA特异识别结合域是由一系列数目不定的串联重复单元组成。每个重复单元通常由34个氨基酸组成[46]，其中32个氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可变化的，这2个氨基酸又被称为重复可变双残基（Repeat variable diresidue，RVD）。每个重复单元只识别1个核苷酸，其识别的特异性由RVD决定，并且RVD可与4种碱基有特定的配对关系，即NI特异识别A，HD特异识别C，NG特异识别T，NH特异识别G，NN对应G或A[41，46]。研究发现，第12位氨基酸主要起稳定RVD环的功能，第13位氨基酸是真正识别特异碱基的氨基酸，决定识别的特异性[44，47]（图2a）。
FokⅠ与TALE的C端融合形成TALEN。对靶DNA进行切割时，FokⅠ也需要形成二聚体发挥切割作用，当两个TALEN分别结合到各自的靶DNA序列上时，2个FokⅠ会在靶DNA序列的间隔区（Spacer，14～18 bp）处形成二聚体[48]，并对靶DNA进行切割，形成DSB切口，进而引发细胞内的NHEJ和HR修复机制，导致基因沉默（图2b）。总之，通过构建不同的TALE就可实现对不同靶DNA的切割。
4.2 TALEN技术的应用
TALEN技术的发明使得基因组编辑效率明显提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑马鱼、水稻、拟南芥等物种中得到广泛应用。①遗传病治疗方面的应用。科研人员利用TALEN技术对来源β-地中海贫血病人的非整合型iPSCs进行珠蛋白基因HBB修复，研究发现细胞在修复过程中没有产生TALEN引发的脱靶突变并且这些修复好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明这种方法可作为一种治疗地中海贫血疾病的有效途径[50]。②生物模型的构建。2014年中国科学家利用TALEN技术成功的敲除了食蟹猴基因。首次用该技术成功构建了非人类灵长类动物模型[51]。③新品种的培育。Li等[52]利用TALEN技术剔除掉了水稻基因组中对水稻白叶枯病敏感基因Os11N3，获得了稳定遗传的抗病水稻新品种。这也显示出了TALEN技术介导的基因定点修饰在作物遗传育种中具有广阔的应用前景。
4.3 TALEN技术的优缺点
作为第二代人工合成的核酸内切酶技术，与ZFN技术相比，TALEN技术具有明显的优势。①与ZFN技术相比，TALEN筛选更为简便，它不需要复杂的筛选过程，只需要简单的分子克隆技术就可以获得高效的TALEN。②脱靶现象减少，降低了对细胞的毒性。③切割位点的特异性强。
TALEN技术虽然有很多优点，但也存在许多不足。主要包括：①TALE蛋白较大，并且序列重复性很强，构建表达载体较为复杂[53]。一般由生物公司合成，r格较贵。②仍然存在脱靶现象。③一对TALEN只能对一个靶基因进行修饰。当对多个基因同时进行编辑时，需要共转染多个TALEN载体，这样会导致转染效率下降，很难获得所需的阳性细胞[54]。
5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技术
1987年Ishino等[55]首先在大肠杆菌的碱性磷酸酶基因下游发现了成簇的短间隔重复序列，但该序列当时没有引起人们的足够重视。随着研究的不断深入，发现大约40%的细菌和90%的古生菌都存在这种成簇的短间隔重复序列。2002年这种成簇的短间隔重复序列被命名为串联间隔短回文重复序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位点附近还存在着多个与CRISPR相关的Cas（CRISPR-associated genes）基因。随后的研究又发现，CRISPR中的间隔序列与质粒或噬菌体等外源DNA序列高度同源。当病毒入侵宿主细胞时，细菌和古细菌中的CRISPR序列就能够引导CRISPR相关（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，从而起到免疫保护的作用[58]。
5.1 CRISPR-Cas系统的结构及作用机理
CRISPR-Cas系统主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白组成[59]。目前，CRISPR-Cas系统一般被分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统在介导靶DNA双链降解时需要多种Cas蛋白的参与，而Ⅱ型CRISPR-Cas系统只需要Cas9就可完成对靶DNA双链的切割[60]。通过比较，Ⅱ型CRISPR-Cas系统更为简便，更适合应用于基因编辑。目前，CRISPR-Cas技术主要是Cas9系统的应用，本研究将对CRISPR-Cas9系统进行阐述。
CRISPR序列元件主要是由一个前导序列（Leader）、多个重复序列（Repeats）及多个间隔序列（Spacers）组成，其中重复序列和间隔序列以相互交替的方式连接（图3）。前导序列是一段富含AT，长度为550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可启动CRISPR序列转录；重复序列是一组长度为23～50 bp，平均长度为31 bp的高度保守的短小序列；间隔序列为来源于噬菌体、质粒等的平均长度为36 bp的外源基因片段即原间隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一个多结构域蛋白，主要由α-螺旋组成的识别区（REC）、位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域、 位于氨基末端的RuvC-like结构域以及位于C端的PAM结合区组成[62]。
CRISPR-Cas9系统[63]的作用机理可分为3个阶段：①可变间隔序列的获得[64]。CRISPR-Cas9系统能够识别外源核酸中的特殊片段，该特殊片段中存在原型间隔序列毗邻基序（Protospacer-associated motif，PAM），并将PAM旁的原型间隔序列加工整合入自身基因组中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前导序列的启动下CRISPR转录产生前体CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），随后CRISPR转录产生的tracrRNA（trans- activating crRNA）与pre-crRNA形成RNA异二聚体，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③对外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9结合形成一个三元的沉默复合物。而后在crRNA的引导下由Cas9蛋白对目的基因进行切割。在切割时Cas9蛋白的HNH能够特异性识别与crRNA互补配对的模板链并对其切割，切割位点位于PAM上游3 nt处；RuvC-1ike参与另一条链特定位点的切割，切割位点位于PAM上游3～8 nt处（NGG位点）[65]。Cas9蛋白对外源DNA进行切割后也会产生DSB切口，并通过NHEJ和HR的方式进行修复[66]（图4）。因此，通过设计不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]将成熟的crRNA和tracrRNA这两种RNA构建成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）与Cas9融合，发现由sgRNA和Cas9蛋白构成的新CRISPR-Cas系统仍可对目的基因进行切割。所以，可将CRISPR-Cas9系统简化成Cas9蛋白与sgRNA。
5.2 CRISPR-Cas系统的应用
目前，CRISPR-Cas系统的应用仍处在初级阶段，但在基因功能的研究、模式生物的构建、遗传育种等方面得到广泛应用。①在基因功能研究中的应用。与传统的基因敲除技术相比，CRISPR-Cas系统能够对多种细胞及生物体的目的基因进行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]构建了一个含有65 000种sgRNA的文库，这些sgRNA可以靶向人类基因组中18 080种基因，几乎涵盖了每个已知的基因。并将编码这些sgRNA的基因和编码Cas9蛋白的基因一起转运到人类细胞中，从而筛选出具有特定功能的基因。②动物模型的构建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干细胞中使用CRISPR-Cas9系统，对Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8这5个基因进行同时编辑，产生了基因敲除新个体。这为研究基因家族成员的功能相关性提供新方法。③新品种的改良与培育方面的应用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技术去掉了一个小麦基因，得到了耐白粉病的小麦新品种。还利用CRISPR-Cas9技术定点突变了水稻和小麦两种作物的OsPDS和TaMLO基因，发现原生质体中基因突变效率为14.5%～38.0%，水稻转基因植物中突变效率4.0%～9.4%，并且在T0代获得了水稻纯合PDS突变体，呈现预期的白化和矮小表型。
5.3 CRISPR-Cas系统的优缺点
作为第三代人工合成的核酸酶，与ZFN技术和TALEN技术相比具有明显的优势。主要表现在：①CRISPR-Cas系统的切割能力更强。CRISPR-Cas系统可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位点[71]。②操作更为简便，试验周期更短，成本更低。突变不同的靶位点只需设计与靶位点互补的sgRNA，然后将sgRNA克隆到表达质粒上即可。③CRISPR-Cas系统可以同时对多个靶基因进行定点修饰，因此大大提高了修饰效率。
CRISPR-Cas系统的应用仍处于初级阶段，存在许多不足：①5′-GN19NGG-3′的结构有时会出现限制性，会对靶位点以外的序列进行编辑，产生多余的DNA突变[72]。②CRISPR-Cas系统识别靶序列的长度较短，不能根据需求进行调节。③仍存在脱靶现象。
6 展望
基因功能缺失技术已经在生物学各个领域得到广泛应用，成为了研究基因的主要方法。随着基因功能缺失技术的不断更新，已从反义RNA技术发展到了CRISPR-Cas技术，并且其应用范围越来越广泛，对目的基因的编辑效率越来越高，操作越来越简便。目前基因功能缺失技g仍存在许多不足，限制了其发展。随着研究的不断深入与发展，基因功能缺失技术必将得到不断改进和完善，也一定会对基因功能方面的研究做出更大的贡献。
参考文献：
[1] SIMONS R W. Naturally occurring antisense RNA control-a brief review[J].Gene，1988，72（1-2）：35-44.
[2] 宫 明，宫 锋.反义RNA调控的不同方式[J].生命的化学（中国生物化学会讯），1996，16（4）：17-18.
[3] TU H Y，LIU Y F. The mechanism of antisense RNA and its application in the plant gene engineering[J].Biomagnetism，2005，5（2）：32-34.
[4] OELLER P W，LU M W，TAYLOR L P，et al.Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA[J].Science，1991，254（5030）：437-439.
[5] NELSON A，ROTH D A，JOHNSON J D.Tobacco mosaic virus infection of transgenic Nicotiana tabacum plants is inhibited by antisense constructs directed at the 5′ region of viral RNA[J]. Gene，1993，127（2）：227-232.
[6] YOUNG K，JAYASURIYA H，ONDEYKA J G，et al.Discovery of FabH/FabF inhibitors from natural products[J]. Antimicrob Agents Chemother，2006，50（2）：519-526.
[7] 丁月月，李 霜，黄 和.反义RNA技术在丝状真菌代谢工程中的应用[J].生物工程学报，2009，25（9）：1316-1320.
[8] 莫 凡，王传之，朱永智，等.反义RNA在水稻遗传育种研究中的应用[J].广东农业科学，2008（4）：8-9.
[9] 张西锋，沈 伟，潘庆杰，等.反义RNA技术原理及其在疾病治疗中的应用[J].莱阳农学院学报，2004，21（1）：20-22，33.
[10] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdit is elegans[J]. Nature，1998，391（6669）：806-811.
[11] NAPOLI C，LEMIEUX C，JORGENSEN R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.[J]. Plant Cell，1990，2（4）：279-289.
[12] COGONI C，ROMANO N，MACINO G.Suppression of gene expression by homologous transgenes[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，1994，65（3）：205-209.
[13] GUO S，KEMPHUES K J. Par-1， a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos， encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell，1995，81（4）：611-620.
[14] BERNSTEIN E，CAUDY A A，HAMMOND S M，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature，2001，409（6818）：363-366.
[15] SONTHEIMER E J. Assembly and function of RNA silencing complexes[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6（2）：127-138.
[16] ZAMORE P D. RNA interference： Listening to the sound of silence[J]. Nat Struct Biol，2001，8（9）：746-750.
[17] DOGINI D B，AVANSINI S H，VIEIRA A S，et al.The new world of RNAs[J].Genet Mol Biol，2014，37（1）：285-293.
[18] AN Y，CAI Y，GUAN Y，et al. Inhibitory effect of small interfering RNA targeting insulin-like growth factor-I receptor in ovarian cancer OVCAR3 cells[J].Cancer Biother Radiopharm，2010，25（5）：545-552.
[19] 毛颖波，薛学义，陈晓亚.植物小RNAcRNA干扰：生物学功能与应用前景[J].中国科学（生命科学），2009，39（1）：31-43.
[20] YU D M，HAO L J，WANG D Y，et al. Influence of RNA interference mediated cyclinD1 gene silencing on the proliferation and G1 phase regulators of fibroblasts derived from keloid[J]. Prog Biochem Bio-phys，2008，35（2）：159-169.
[21] 袁成良，金晓岚.RNA干扰原理及应用研究进展[J].西部医学，2009（4）：664-666.
[22] JIN P，ZARNESCU D S，CEMAN S，et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway[J].Nat Neurosci，2004，7（2）：113-117.
[23] MAKIMURA H，MIZUNO T M，MASTAITIS J W，et al. Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influencing food intake[J]. BMC Neurosci，2002（3）：18.
[24] DUFF C J，HOOPPER N M.PCSK9：An emerging target for treatment of hypercholesterolemia[J]. Expert Opin Ther Targets，2011，15（2）：157-168.
[25] MCMANUS M T，SHARP P A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs[J]. Nat Rev Genet，2002，3（10）：737-747.
[26] 张巧丽，黄金昶.RNAi技术及其在肿瘤学应用方面的研究进展[J].中国临床医生杂志，2015，43（1）：14-17.
[27] KIM Y G，CHA J，CHANDRASEGARAN S. Hybrid restriction enzymes： Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（3）：1156-1160.
[28] BIBIKOVA M，CARROLL D，SEGAL D J，et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases[J].Mol Cell Biol，2001，21（1）：289-297.
[29] BIBIKOVA M，GOLIC M，GOLIC K G，et al. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases[J].Genetics，2002，161（3）：1169-1175.
[30] WOLFE S A，NEKLUDOVA L，PABO C O. DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct，2000，29：183-212.
[31] PABO C O，PEISACH E，GRANT R A. Design and selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins[J].Annu Rev Biochem，2001，70：313-340.
[32] HAUSCHILD Q J，PETERSEN B，COST G J，et al. Gene knockout and knockin by zinc-finger nucleases： Current status and perspectives[J]. Cell Mol Life Sci，2013，70（16）：2969-2983.
[33] PALPANT N J，DUDZINSKI D. Zinc-finger nucleases：Looking toward translation[J].Gene Ther，2013，20（2）：121-127.
[34] 白雪，孙其信，李海峰.基因修饰技术研究进展[J].生物工程学报，2015，31（8）：1162-1174.
[35] URNOV F D，REBAR E J，HOLMES M C，et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases[J]. Nat Rev Genet，2010，11（9）：636-646.
[36] ZHANG F，MAEDER M L，UNGER W E，et al.High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（26）：12028-12033.
[37] LI H，HAURIGOT V，DOYON Y，et al. In vivo genome editing restores hemostasis in a mouse model of haemophilia[J].Nature，2011，475（7355）：217-221.
[38] SANDER J D，DAHLBORG E J，GOODWIN M J，et al. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly（CoDA）[J].Nat Methods，2011，8（1）：67-69.
[39] BONAS U，STALL R E，STASKAWICZ B. Genetic and structural characterization of the avirulence gene avrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria[J].Mol Gen Genet，1989， 218（1）：127-136.
[40] KAY S，HAHN S，MAROIS E，et al. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator[J].Science，2007，318（5850）：648-651.
[41] MOSCOU M J，BOGDANOVE A J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors[J].Science，2009，326（5959）：1501.
[42] CHRISTIAN M，CERMAK T，DOYLE E L，et al.Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases[J].Genetics，2010，186（2）：757-761.
[43] LI T，HUANG S，JIANG W Z，et al. TAL nucleases （TALNs）：Hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain[J].Nucleic Acids Research，2011，39（1）：359-372.
[44] DENG D，YAN C，PAN X，et al.Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors[J].Science，2012，335（6069）：720-723.
[45] 周 维，付喜爱，张德显，等.基因敲除技术的研究进展[J].中国兽医杂志，2015，51（3）：67-69.
[46] BOCH J，SCHOLZE H，SEBASTIAN S，et al.Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[J].Science，2009，326（5959）：1509-1512.
[47] MAK A N，BRADLEY P，CERNADAS R A，et al. The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target[J]. Science，2012，335（6069）：716-719.
[48] MILLER J C，TAN S，QIAO G，et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing[J]. Nat Biotechnol，2011， 29（2）：143-148.
[49] JOUNG J K，SANDER J D. TALENs： A widely applicable technology for targeted genome editing[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2012，14（1）：49-55.
[50] MA N，LIAO B，ZHANG H，et al. TALEN-mediated gene correction in integration-free β-thalassemia iPSCs[J]. J Biol Chem，2013，288（48）：34671-34679.
[51] LIU H，CHEN Y，NIU Y，et al. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys[J].Cell Stem Cell，2014，14（3）：323C328.
[52] LI T，LIU B，SPALDING M H，et al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice[J].Nat Biotechnol，2012，30（5）：390-392.
[53] 纹嫖埃高彩霞.植物基因组编辑及衍生技术最新研究进展[J].遗传，2015，37（10）：953-973.
[54] 李 东，左其生，张亚妮，等.基因组编辑技术的研究进展[J].畜牧与兽医，2015（7）：124-129.
[55] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product[J].J Bacteriol，1987，169（12）：5429-5433.
[56] MOJICA F J M，D？EZ-VILLASE？mOR C，SORIA E，et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea，Bacteria and mitochondria[J].Mol Microbiol，2000，36（1）：244-246.
[57] JANSEN R，EMBDEN J D，GAASTRA W，et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].Mol Microbiol，2002，43（6）：1565-1575.
[58] 黄 蕾，王雅洁，陈 实.非编码RNA编辑技术研究进展[J].中国细胞生物学学报，2015，37（7）：1036-1045.
[59] w 欣，胡 军.CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物中的研究进展[J].中国农学通报，2015，31（12）：187-192.
[60] DELTCHEVA E，CHYLINSKI K，SHARMA C M，et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature，2011，471（7340）：602-607.
[61] MARRAFFINI L A，SONTHEIMER E J.CRISPR interference： RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea[J].Nat Rev Genet，2010，11（3）：181-190.
[62] NISHIMASU H，RAN F A，HSU P，et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J].Cell，2014，156（5）：935-949.
[63] 倪培凌，刘 畅，陈凌懿.DNA剪刀――TALEN和CRISPR/Cas[J].中国细胞生物学学报，2014，36（1）：5-11.
[64] 刘思也，夏海滨.一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J].中国生物工程杂志，2013，33（10）：117-123.
[65] FRIEDLAND A E，TZUR Y B，ESVELT K M，et al.Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system[J]. Nat Methods，2013，10（8）：741-743.
[66] WIEDENHEFT B，STERNBERG S H，DOUDNA J A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J].Nature，2012，482（7385）：331-338.
[67] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.
[68] SHALEM O，SANJANA N E，HARTENIAN E，et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells[J].Science，2014，343（6166）：84-87.
[69] WANG H，YANG H，SHIVALILA C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153（4）：910-918.
[70] SHAN Q，WANG Y，LI J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J].Nat Biotechnol，2013，31（8）：686-688.
[71] JINEK M，EAST A，CHENG A，et al.RNA-programmed genome editing in human cells[J]. Elife，2013，2：471.
[72] FU Y，FODEN J A，KHAYTER C，et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells[J]. Nat Biotechnol，2013，31（9）：822-826.