RP-HPLC法测定灵虎片中虎杖苷的含量
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[摘要］目的：建立复方制剂灵虎片中的有效成分虎杖苷的含量测定方法。方法: 采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水（25∶75）为流动相；检测波长：305 nm；流速：1.0 ml/min。柱温：室温。结果：虎杖苷在38.98~389.80 μg范围内成良好线性关系，r＝0.9998，平均回收率为100.23%，RSD为1.67%。结论：本测定方法简便可行、重复性好，可用于本制剂中有效成分虎杖苷的含量测定。
[关键词]灵虎片；虎杖苷；rp-hplc
[中图分类号]RO657 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）06（c）-024-05
Study on the determination of polydatin in Linghu tablets by RP-HPLC
XU Xiao-feng1，LIN Bin2，WANG Pei-jian1
(1.GuangZhou University of Traditional Chinese Medicine，GuangZhou510405，China；2.Guangdong Provincial People’s Hospital，GuangZhou510080，China)
[Abstract]Objective：To determine the concents of baicalin in polydatin in Linghu tablets.Methods：The HPLC method was established for the determination of polydatin in Linghu tablets. The column is Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，mobile phase consisting of acetonitrile-water（25∶75），column tempreture room temperature,and the flow rare was 1.0 ml/min．The detection wavelength is 305 nm．Results：A better linearity was obtained form 38.98 μg to 398.80 μg of polydatin for plasma with a good correlation coefficient．The average recovery of ephedrine hydrochloride was 100.23%，RSD was 1.67%，The method has good precision．recocry.Conclusion：This method is simple，and quick．it can be used as quality control in Linghu tablets.
[Key words]Polydatin；Linghu tablets；RP-HPLC）
复方制剂灵虎片由灵芝，虎杖，山楂，三七，丹参等多种中药组成，具有活血祛瘀，疏肝益气，清热祛湿的功效。临床主要用于慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化等疾病的治疗。方中虎杖为常用传统中药，具有祛除风湿,利湿退黄,活血通经,祛痰止咳,清热解毒的功效，善于清肺脏热邪，临床上已沿用千年。近代大量的实验研究证明，方中虎杖所含的虎杖苷是虎杖及其制剂的主要质量控制指标成分, 据药理学研究报道, 虎杖对鸭乙型病毒、乙肝病毒均有良好抑制效果[1]；虎杖煎剂对CCl4所致肝损伤有一定保护作用，对大鼠匀浆脂质过氧化具有抑制作用[2]。实验证明虎杖苷对Fe2+和抗环血酸为自由基发生系统所引起的脂质过氧化有很强的抑制作用，能有效保护CCl4造成的原代培养大鼠肝细胞损伤[3]。为建立灵虎片的质量控制方法，我们采用HPLC法测定该制剂中虎杖苷的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（DIONEX P680 HPLC），ASI-100型自动进样器，PDA-100型紫外检测器，STH585柱温控制器，Chromeleon色谱工作站，SB-5200超声波清洗机（宁波新芝科器研究所），实验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有限公司)。
1.2 药物与试剂
灵虎片（宁夏建业制药厂提供，批号分别为20060121、20050620、20050923）；虎杖苷对照品，购自中国药品生物制品检定所，批号：111575-200501。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水（25∶75）为流动相；检测波长：303 nm；流速：1.0 ml/min。柱温：室温。在此条件下虎杖苷与其他组分能达到较好分离（图1、2）。
图1虎杖苷标准品高效液相色谱图
图2灵虎片高效液相色谱图
2.2 标准曲线的制备
精密称取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的虎杖苷对照品12.18 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得标准品溶液。分别吸取虎杖苷对照品溶液2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 μl进样，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，虎杖苷的进样量为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程为：Y=7.4686X+0.7551，r=0.9998。结果表示虎杖苷进样量38.98~389.80 μg 范围内呈良好的线性关系。
2.3 供试品溶液的制备
取灵虎片约100 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 ml，超声提取(300 W)30 min，取出，放冷，转入50 ml棕色量瓶中，用甲醇定容，取1 ml转至5 ml棕色量瓶中，用甲醇定容，摇匀。微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.4 精密度试验
取对照品溶液重复进样6次，每次10 μl。测得虎杖苷的峰面积RSD为1.02%，表明仪器的精密度良好。
2.5 稳定性试验
精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样6次，每次间隔2小时，测得虎杖苷峰面积RSD为0.65%，结果表明标准品在12 h内稳定。
2.6 重复性试验
按拟定的含量测定方法，取同一样品溶液（批号：20050620），平行制备6份，测得峰面积并计算含量，结果测得虎杖苷含量的RSD为1.07%。
2.7 空白实验
按原方工艺(全方除去虎杖)，制成成药空白片，然后按照样品测定的方法进行测定。结果表明，灵虎片的阴性(空白)对照液在虎杖苷的色谱峰处未见明显吸收，表明无干扰（图3）。
图3缺虎杖药材阴性对照图
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的灵虎片约0.1 g，共6份，分别置25 ml量瓶中，各精密加入一定浓度的对照品溶液(2．2项下对照品溶液)5 ml，加甲醇至25 ml，摇匀，照供试品溶液同法制备，按上述色谱条件，每次进样10 μl，测定虎杖苷含量，计算回收率，结果表明：本方法准确度良好。虎杖苷平均回收率为100．23％，RSD=1.67％(n=6)。测定结果见表1。
2.9 含量测定
按供试品溶液制备方法和色谱条件对3批样品进行了测定，结果见表2。
3 讨论
根据方中药材所含成分的文献资料, 因虎杖药材中虎杖苷含量较多, 且药效明确，故选择虎杖苷含量测定作为含量控制指标。本实验曾采用多种流动相，如甲醇系统，乙腈缓冲盐系统[4]，但比较发现甲醇系统分离效果欠佳，而乙腈缓冲盐系统虽然分离效果尚可，但对色谱柱损伤较大，操作也较繁琐，最后我们最终参考2005版《中国药典》的流动相加以改进后的系统乙腈－水（25∶75）达到了比较好的分离效果：出峰时间适宜，阴性无干扰，样品峰形和分离效果好[5]。
根据方法学考察结果表明，该方法简便，可行，重现性良好，能有效控制灵虎片的质量。
[参考文献]
[1]米志宝，陈鸿珊，张习坦，等.用噬肝DNA病毒模型筛选抗病毒中药[J].中国中药杂志，1997，22（1）：43－45.
[2]刘蕾，李莉，张蕊，等.虎杖对小鼠CCL4性肝损伤的保护作用[J].黑龙江医药科学，2001，24（3）：20－21.
[3]黄兆胜，王宗伟，刘明平，等.虎杖苷对CCL4损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用[J].中国药理学通报，1998，14（6）：543－545.
[4]林芸竹，龚涛，张志荣.复方虎杖降脂胶囊中虎杖的鉴别和虎杖苷的含量测定[J].华西药学杂志，2005，20(6)：544-545.
[5]国家药典委员会．中华人民共和国药典2005版(一部)[M]．北京：化学工业出版社，2005.
（收稿日期：2007-04-26）
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