UHPLC―Q―TOF―MS分析枳壳炮制前后成分变化
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[摘要] 利用uhplc-Q-tof-ms对同一批枳壳药材生品饮片及其炮制品进行分析，比较炮制前后成分变化，探讨粤港枳壳饮片发酵炮制机制的物质基础。通过比对生品与炮制品的正负离子模式离子流出峰，并以化合物炮制前后离子峰面积比为炮制前后变化指数进行比对。结果发现枳壳经发酵炮制后，产生圣草酚-7-O-葡糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、5-去甲基川陈皮素等3个新生成分，并可显著增加柚皮素和橙皮素成分，以及明显增加柠檬苦素，sudachinoid A，黄柏酮酸，诺米林酸等柠檬苦素类衍生物成分。提示粤港枳壳饮片所采用的发酵为主的方法对提升炮制品的生物活性和生物利用率，增强临床疗效具有重要意义，值得加强保护和进一步推广。
[关键词]枳壳；发酵炮制；UHPLC-Q-TOF-MS
[Abstract] To explore the processing mechanism of Aurantii Fructus decoction pieces used in Guangdong province and Hong Kong by analysing the chemical variation between raw and processed Aurantii Fructus with different methods based on UHPLC-Q-TOF-MS. The total ion chromatograms detected in positive and negative ion modes， and ion peak area ratio before and after processing were taken as variation indexes in the comparison. The results indicated that fermented Aurantii Fructus could produce three new ingredients， namely eriodictyol-7-glucoside， hesperetin-7-O-glucoside and 5-demethylnobiletin. At the same time， it could significantly increase the content of naringenin and hesperetin components， and could increase the content of such limonin derivatives as sudachinoid A， obacunoic acid and limoninand nomilinic acid. This suggests that the fermentation processing method of Aurantii Fructus decoction pieces used in Guangdong province and Hong Kong is of important significance for enhancing biological activity and bioavailability， and improving the clinical efficacy of Aurantii Fructus decoction pieces， and so is worth further protection and promotion.
[Key words] Aurantii Fructus； fermentation processing； UHPLC-Q-TOF-MS
doi：10.4268/cjcmm20161116
枳壳是中医临床常用的一种药材，《中国药典》2015年版收载的枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实，经洗净，润透后切薄片作饮片用[1]。粤港地区的传统枳壳饮片炮制沿袭于《中药炮制经验集成》记载的枳壳蒸切炮制方法，即取原药材，去核及瓤，加水浸透，待发酵后，蒸至紫褐色，切片即可[2]。这种方法有别于《中国药典》收载的炮制方法，然而，为何在粤港地区仍延用有发酵工艺的炮制方法，一直未获得科学的解释，为此，本文采用UHPLC-Q-TOF-MS分析比较炮制前后成分的变化，探索其炮制机制，为今后科学评价此种炮制方法提供实验依据。
1 材料
枳壳原药材，已除去杂质及瓤核，产地四川，购于四川新荷花中药饮片厂（批号D1301099），经广州中医药大学李薇教授鉴定为芸香科植物酸橙C. aurantium的干燥未成熟果实。
超高效液相色谱仪附超高解析质量精确度四极杆飞行时间质谱仪（Agilent 6540，USA），MT5电子天平（Mettler-Tole-do，Switzerland），5810离心机（Eppendorf，Germany），1875HT 恒温超声波清洗器（CREST，USA），色谱级乙腈（Merck，Germany），色谱级甲酸（Fluka，Switzerland），色谱级甲醇（Merck，Germany），Milli-Q超纯水系统（Millipore，France）。
2 枳壳炮制
2.1 生品枳壳饮片 随机取枳壳原药材样品，参考《中国药典》2010年版枳壳饮片的炮制要求[3]，除去杂质，洗净，加水润透，切薄片，干燥。随机抽取100 g，磨粉过20目筛。
2.2 麸炒枳壳饮片 参考《中国药典》2010年版麸炒的炮制通则及麸炒枳壳饮片的炮制要求[3]，随机抽取2.1项生品枳壳饮片。将炒制容器加热，至撒入适量麸皮即刻烟起，随即投入生品枳壳饮片，迅速翻动，炒至表面呈黄色或深黄色时，取出，筛去麸皮，放凉。随机抽取100 g，磨粉过20目筛。
2.3 蒸枳壳对照饮片 随机抽取枳壳原药材，洗净，加水浸透，蒸3 h，闷1夜，至内部呈紫褐色时，取出，切片，干燥。随机抽取100 g，磨粉过20目筛。
2.4 发酵枳壳对照饮片 随机抽取枳壳原药材，洗净，加水浸透，装入麻袋，依温度30 ℃，湿度70%， 7 d发酵后，取出洗净，切片，干燥。随机抽取100 g，磨粉过20目筛。
2.5 粤港枳壳饮片 随机抽取枳壳原药材，洗净，加水浸透，装入麻袋，依温度30 ℃，湿度70%，7 d发酵后，取出洗净，蒸3 h，闷1夜，至内部呈紫褐色时，取出，切片，干燥。随机抽取100 g，磨粉过20目筛。
3 方法
3.1 供试样品的制备 精密称取样品粉末10 mg，分别精密加入甲醇1 mL，在50 ℃恒温超声波清洗器中超声提取30 min，3 500 r・min-1离心15 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜（PTFE）滤过，分别制得生品枳壳饮片、麸炒枳壳饮片、蒸枳壳对照饮片、发酵枳壳对照饮片、粤港枳壳饮片供试溶液。
3.2 色谱条件 Waters ACQUITY UHPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，95%～65% A；10～18 min，65%～25% A；18～21 min，25%～0% A；21～24 min，0% A；24～24.1 min，0%～95% A；24.1～28 min，95% A），流速0.4 mL・min-1；柱温40 ℃；进样量1 μL。
3.3 质谱条件 ESI离子源，在正负离子模式下采集数据。扫描范围m/z 100～1 700。离子源参数：干燥气（N2），流速8 L・min-1；雾化压力310.26 kPa；干燥气温度300 ℃；毛细管电压3 500 V，裂解电压150 V。
4 结果
5个供试样品溶液的正负离子模式离子流出峰顺序见图1。对主要色谱峰物质进行精确质量数定性分析和二级碎片结构分析，并结合TOF-MS匹配出的可能分子式，检索ChemSpider网络化学数据库及参考文献[4-6]，鉴定出30个可能化合物，其中二氢黄酮类16个，黄酮类6个，香豆素类3个，柠檬苦素萜类5个。鉴定的可能化合物及其保留时间和质谱信息见表1。
在正离子模式下和负离子模式下每个对应色谱峰的保留时间、准分子离子峰和二级质谱碎片信息均基本相同的情况下，每个色谱峰的峰面积变化可以反映对应化合物含量的变化[7]。以各炮制供试液离子峰面积除以对应保留时间的生品枳壳饮片离子峰面积为其炮制前后变化指数，炮制前后变化指数接近1表示此离子峰对应的化合物炮制前后含量相近，炮制前后变化指数大于1表示此离子峰对应的化合物炮制后含量增加，炮制前后变化指数小于1表示此离子峰对应的化合物炮制后含量减少。枳壳炮制品在正离子模式下的离子峰面积及其炮制前后变化指数见表2，在负离子模式下的离子峰面积及其炮制前后变化指数见表3。
发酵枳壳对照饮片和粤港枳壳饮片经发酵炮制后，产生化合物3（圣草酚-7-O-葡糖苷）、化合物12（橙皮素-7-O-葡萄糖苷）、化合物20（5-去甲基川陈皮素）3个新生成分，同时化合物16（柚皮素）和化合物17（橙皮素）成分显著增加，化合物18（sudachinoid A）、化合物22（黄柏酮酸）、化合物24（柠檬苦素）、化合物25（诺米林酸）等成分明显增加。
麸炒枳壳饮片与蒸枳壳对照饮片经炮制后，除化合物2（narirutin 4′-glucoside）、化合物16和化合物17比炮制前含量略有增加外，其他成分普遍比炮制前含量减少。
5 质谱分析
5.1 对发酵炮制新生成分鉴定 化合物3在正离子模式下无出现离子峰，在负离子模式下的准分子离子峰m/z449[M-H]-，离子化后有4个碎片离子峰m/z287[M-H-162]-，m/z107[M-H-162-180]-，m/z151[M-H-162-136]-，m/z135[M-H-314]-。结合TOF-MS匹配出的可能分子式C21H22O11进行结构鉴定，检索ChemSpider网络化学数据库，推测可能是二氢黄酮类化合物eriodictyol-7-glucoside，其离子化裂解分析见图2。
化合物12在正离子模式下的准分子离子峰m/z465[M+H]+，离子化后有3个碎片离子峰m/z303[M+H-162]+，m/z153[M+H-162-150]+，m/z177[M+H-288]+。在负离子模式下的准分子离子峰m/z463[M-H]-，离子化后有5个碎片离子峰m/z301[M-H-162]-，m/z286 [M-H-162-CH3]-，m/z151[M-H-162-150]-，m/z242[M-H-204-OH]-，m/z164[M-H-179-120]-。结合TOF-MS匹配出的可能分子式C22H24O11进行结构鉴定，检索ChemSpider网络化学数据库，推测可能是二氢黄酮类化合物hesperetin-7-O-glucoside，其离子化裂解分析见图3。
化合物20在负离子模式下无出现离子峰，在正离子模式下的准分子离子峰m/z389[M+H]+，离子化后有3个碎片离子峰m/z374[M+H-CH3]+，m/z359[M+H-2CH3]+，m/z341[M+H-2CH3-H2O]+。
结合TOF-MS匹配出的可能分子式C20H20O8进行结构鉴定，检索ChemSpider网络化学数据库，推测可能是黄酮类化合物5-demethylnobiletin，其离子化裂解分析见图4。
5.2 对发酵炮制变化显著成分鉴定 化合物16在正离子模式下的准分子离子峰m/z273[M+H]+，离子化后有4个碎片离子峰m/z255[M+H-H2O]+，m/z153[M+H-120]+，m/z119[M+H-154]+，m/z147[M+H-126]+。在负离子模式下的准分子离子峰m/z271[M-H]-，离子化后有4个碎片离子峰m/z187[M-H-84]-，m/z151[M-H-120]-，m/z119[M-H-152]-，m/z107[M-H-164]-。结合TOF-MS匹配出的可能分子式C15H12O5进行结构鉴定，检索ChemSpider网络化学数据库，并参考文献[5-6]，推测可能是二氢黄酮类化合物naringenin，其离子化裂解分析见图5。
化合物17在正离子模式下的准分子离子峰m/z303[M+H]+，离子化后有4个碎片离子峰m/z177[M+H-126]+，m/z153[M+H-150]+，m/z145[M+H-126-32]+，m/z117[M+H-154-32]+。在负离子模式下的准分子离子峰m/z301[M-H]-，离子化后有8个碎片离子峰m/z164[M-H-137]-，m/z151[M-H-150]-，m/z136[M-H-165]-，m/z125[M-H-176]-，m/z286[M-H-CH3]-，m/z174[M-H-127]-，m/z199[M-H-C4H4O2-H2O]-，m/z258[M-H-C2H3O]-。结合TOF-MS匹配出的可能分子式C16H14O6进行结构鉴定，检索ChemSpider网络化学数据库，并参考文献[5-6]，推测可能是二氢黄酮类化合物hesperetin，其离子化裂解分析见图6。
6 讨论
化合物1，4～6，8，9，11，15～17，22，24，25在正负离子模式下都出现离子峰，其中化合物5，6，8，9，11，15，24在正负离子模式下炮制前后变化指数基本相近，而化合物1，4，16，17，22，25在正负离子模式下炮制前后变化指数出现较大差异，推测可能是生品枳壳饮片的这些化合物的离子峰面积较少，由于峰面积积分操作有误差，以此作为分母去计算炮制前后变化指数时，会引至炮制前后变化指数结果在正负离子模式下有较大的差异，而这差异不影响对实验结果的判断。
实验结果显示发酵枳壳对照饮片和粤港枳壳饮片经发酵炮制后，产生圣草酚-7-O-葡糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、5-去甲基川陈皮素3个新生成分；苷元化合物柚皮素和橙皮素成分显著增加；而黄酮苷类化合物loquatoside，narirutin，hesperidin，hesperetin-5-O-glucoside，narirutin 4′-glucoside，poncirin成分明显减少，黄酮化合物nobiletin，natsudaidain，tangeretin成分减少。提示枳壳经发酵炮制后，产生圣草酚-7-O-葡糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷等次级苷新生成分，以及苷元柚皮素和橙皮素成分大幅增加，是微生物分泌的胞内胞外酶令一些黄酮苷类成分降解为苷元或次级苷所致，推测其化学转化机制见图7，8。枳壳经发酵炮制后，产生5-去甲基川陈皮素新生成分，推测是微生物分泌的胞内胞外酶令一些黄酮化合物甲基化和去甲基化或去羟基所致，其化学转化机制见图9。
另外，发酵枳壳对照饮片和粤港枳壳饮片经发酵炮制后，柠檬苦素苷元类化合物柠檬苦素，sudachinoid A，黄柏酮酸，诺米林酸成分亦明显增加。文献报道芸香科植物中柠檬苦素类化合物主要是柠檬苦素苷元类、降解型柠檬苦素类和糖苷型柠檬苦素类，其中又以苷元居多[10]。实验结果未显示有柠檬苦素糖苷类成分存在和减少，另外，有研究报道微生物分泌的各种胞外酶可分解植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶、木质素等成分，从而破坏细胞壁结构，提高有效成分的提取率[19]。因此推测枳壳经发酵炮制后柠檬苦素苷元类化合物含量增加，有可能是微生物分泌的胞外酶破坏了细胞壁结构，增加了细胞间隙，利于这些成分的溶出。
圣草酚-7-O-葡糖苷成分具有较强的DPPH自由基清除能力[8]。5-去甲基川陈皮素成分具有多样的抗动脉粥样硬化的生物活性，可抑制单核细胞分化巨噬细胞和泡沫细胞形成，而且口服比川陈皮素更有效，具有类似的降血脂活性，可以增强LDL受体基因的表达和活性，降低乙酰辅酶A：甘油二酯酰基转移酶2的表达[9]。柠檬苦素及sudachinoid A、黄柏酮酸、诺米林酸等柠檬苦素类衍生物成分具有抗癌、抗HIV、抗病毒、抗氧化、抗焦虑、降低胆固醇、镇静、催眠、抑菌等多种生物活性[10，20]。表明枳壳经发酵炮制后可提升枳壳的生物活性。
圣草酚-7-O-葡糖苷是新北美圣草苷的次级苷，橙皮素-7-O-葡萄糖苷是橙皮苷和新橙皮苷的次级苷，柚皮素是柚皮苷的苷元，橙皮素是橙皮苷和新橙皮苷的苷元，枳壳经发酵炮制后产生圣草酚-7-O-葡糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷新生成分，并显著增加柚皮素、橙皮素成分。而有研究认为黄酮类物质的芦丁糖基部分（葡萄糖+鼠李糖）阻碍了它在小肠中的吸收[11-14]。黄酮类糖苷完整地到达小肠，需要通过脱糖基化作用才能通过小肠被吸收[15]。柚皮苷口服吸收率极低，口服柚皮素的表观渗透系数是柚皮苷的3倍[16]，将柚皮苷转化为柚皮素在体内更易被吸收。也有研究发现通过橙皮苷酶水解橙皮苷得到它的单糖苷和苷元可以改善橙皮苷的生物利用率[17]。显示枳壳饮片经发酵炮制后，通过微生物作用将苷类成分降解为苷元或次级苷可提升枳壳的生物利用率。
比较5种炮制品的成分变化，结果显示只有发酵枳壳对照饮片和粤港枳壳饮片有新增成分，麸炒枳壳饮片和蒸枳壳对照饮片没有新增成分，反而使已有成分减少。麸炒枳壳饮片和蒸枳壳对照饮片各化合物的炮制前后变化指数结果相近，可能是两者的炮制都是热处理有关，提示炒制和蒸制的加热处理对枳壳成分变化影响相类似。有研究显示枳壳麸炒前后色谱行为基本一致，麸炒后新橙皮苷和柚皮苷含量都减少[18]。与本实验结果显示麸炒枳壳饮片和蒸枳壳对照饮片炮制后化合物数量基本一致，成分含量普遍减少相吻合。表明枳壳经加热过程会令部分成分流失。
粤港枳壳饮片采用发酵后再蒸制处理的目的是起终止微生物继续发酵和灭菌作用，虽然有部分成分增加不及发酵枳壳对照饮片，但粤港枳壳饮片在柚皮苷和新橙皮苷两成分含量基本保持炮制前的水平，而发酵枳壳对照饮片、麸炒枳壳饮片、蒸枳壳对照饮片的柚皮苷和新橙皮苷成分在炮制后明显减少，《中国药典》规定枳壳药材的指标成分为柚皮苷和新橙皮苷[1]，显示粤港枳壳饮片利用发酵炮制产生新成分和提升成分含量之余，保留柚皮苷和新橙皮苷两主要成分含量以达至药典规定，使其药效更适合粤港人群，是一种较具地方特色的炮制方法。
总之，本实验结果提示粤港枳壳饮片所采用的发酵为主的方法对提升炮制品的生物活性和生物利用率，增强临床疗效具有重要意义，值得加强保护和进一步推广。
[参考文献]
[1] 中国药典. 一部[S]. 2015：246.
[2] 王孝涛. 历代中药炮制法汇典・现代部分[M]. 南昌：江西科学技术出版出版社， 1989：243.
[3] 中国药典. 一部[S]. 2010.
[4] 马超一， 高文远， 高颖， 等. 枳壳化学成分和代谢成分的UPLC-PAD-Q-TOF-MS分析[J]. 药物评价研究， 2010， 33（2）：110.
[5] Wu M， Zhang H W， Zhou C， et al. Identification of the chemical constituents in aqueous extract of Zhi-qiao and evaluation of its antidepressant effect[J]. Molecules， 2015， 20：6925.
[6] Najanura Y， Asahi H， Altaf-UI-Amin M， et al. KNApAAck：a comprehensive species-metabolite relationship database[DB/OL]. （2015-10-13）. http：//kanaya. naist. jp/knapsack_jsp/.
[7] 孙佳明， 李娜， 张艳平， 等. HPLC-MS法对通顶散中人参藜芦相反相用物质基础研究[J]. 长春中医药大学学报， 2012， 28（5）：909.
[8] 李超. 槲寄生和扁枝槲寄生化学成分与生物活性研究[D]. 济南：山东大学， 2014.
[9] Yen J H， Weng C Y， Li S， et al. Citrus flavonoid 5-demethylnobiletin suppresses scavenger receptor expression in THP-1 cells and alters lipid homeostasis in HepG2 liver cells[J]. Mol Nutr Food Res， 2011， 55（5）：733.
[10] 王贱荣， 董美玲， 郭跃伟. 芸香科柠檬苦素类化合物及其生物活性研究进展[J]. 国际药学研究杂志， 2009， 36（5）：321.
[11] ARTS I C， SESINK A L， FAASSEN-PETERS M. The type of sugar moiety is a major determinant of the small intestineal uptake and subsequent billary excretion of dietary quercetin glycosides[J]. Br J Nutr， 2004， 91（6）：841.
[12] Erlund I， Kosonen T， Alfthan G. Pharmacokinetics of quercetin from quercetinaglycone and rutin in healthy volunteers[J]. Eur J Clin Pharmacol， 2000， 56（8）：545.
[13] Morand C， Manach C， Crespy V. Quercetin 3-O-betaglucoside is better absorbed than other quercetin forms and is not present in rat plasma[J]. Free Radic Res， 2000， 33（5）：667.
[14] Olthof M R， Hollman P C， Vree T B. Bioavailabilities of quercetin-3-glucoside and quercetin-4′-glucoside do not differ in humans[J]. J Nutr， 2000， 130（5）：1200.
[15] Nemeth K， Plumb G W， Berrin J G. Deglycosylation by small intestinal epithelial cell betaglucosidases is a critical step in the absorption and metabolism of dietary flavonoid glycosides in humans[J]. Eur J Nutr， 2003， 42（1）：29.
[16] 马燕. 柚皮素口服吸收机制及改善其生物利用度的研究[D]. 沈阳：沈阳药科大学， 2006.
[17] Nielsen I L F， Chee W S S， Poulsen L. Bioavailability is improved by enzymatic modification of citrus flavonoid hesperidin in humans：a randomized， double-blind， crossover trial[J]. J Nutr， 2006， 136（2）：404.
[18] 朱正义. 枳壳麸炒前后黄酮苷的分析比较[J]. 中药材， 1994， 17（6）：30.
[19] 张丽霞， 高文远， 王海洋. 微生物技术在中药炮制中的应用[J]. 中国中药杂志， 2012， 37（24）：3695.
[20] 周玉付， 沈媛媛， 周志钦， 等. 柑橘类柠檬苦素抗癌活性研究进展[J]. 中国细胞生物学学报， 2011， 33（5）：548.