血药浓度监测技术进展研究
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治疗药物监测（TDM）在临床指导合理用药、制定个性化给药方案中应用广泛。监测血液中药物或其代谢物浓度是临床或实验室获得信息最直接的方法，因此灵敏、可靠的监测方法是至关重要的。近年来，血药浓度监测技术及方法已经取得了可喜的成就，下面对其进展综述如下。
1常用于监测的药物
在临床用药中，并非所有药物都需要监测，而是对一些治疗指数低、安全范围窄、不良反应强的药物进行监测，根据血药浓度对用药剂量进行及时调整，以较理想的血药浓度达到最佳的治疗效果。常见监测药物见表1［1］。
2血药浓度监测方法
血药浓度监测方法有很多，目前常用的分析方法的可分为三大类：光谱法、色谱法、免疫法［2］。
2．1光谱法
光谱法主要为紫外分光光度法（UV）。其所需仪器一般临床实验室均具备，检测成本低、技术简单、省时、易于推广。但所需样本量大，对于多个成分混合样品不易分离、定量，专属性较差，有一定局限性。以上缺点限制了该类方法在监测血药浓度上的广泛应用。但是，对血药浓度水平较高，安全范围不是特别狭窄的药物，如氨茶碱［3］、苯妥英钠［4］等，仍不失为一种可供选择的方法。
2．2色谱法
色谱法又称层析法。是一种根据标本中各组分理化性质的不同，通过层析作用达到分离，并以适当的方法进行定性、定量的检测技术。由于采用了高效层析和联机检测，用微电脑控制层析条件、洗脱方式和数据处理，其特异度、灵敏度、重复性均好；并且可同时对同一标本中多种药物及其代谢物进行检测；若采用内标法，还可排除部分操作误差。适用于某些药物，当不适合用免疫分析法或无商品试剂盒时，也可用于临床常规监测，故在血药浓度监测中得到广泛应用。下面对一些常用方法的特点进行讨论。2．2．1薄层色谱（TLC）法能同时对体内几种药物进行分离、定量，同高效液相色谱法（HPLC）相比，2种方法测定标本结果均精确、敏感，适用于测定纯的实验室制备混合物和药片［5］。但操作步骤繁琐，对实验人员技术要求较高，而An－tonilli等［6］开发出高效薄层色谱法（HPTLC），可以快速地用于定量测定人血浆中的拉莫三嗪（LTG）、唑尼沙胺（ZNS）和左乙拉西坦（LVT），并且同HPLC和液相色谱－质谱法（LC－MS／MS）方法相比，HPTLC方法简便、快速、精密、准确，适用于常规分析。TLC也可用于药物相关研究等方面，如Perisic－Janjic等［7］运用反相TLC法和HPLC法对新合成的抗惊厥药琥珀酰亚胺衍生物的分子特性和药物相关性进行了研究。2．2．2气相色谱（GC）法分离是在物质能被气化的状态下进行的，即样品必须有挥发性，且耐热，因此遇热不稳定或极性大的样品无法实现GC的监测，可应用GC进行血药浓度监测的药物种类受到限制。目前随着固定相的发展以及衍生化技术的应用，使很多样品的监测不再受限制。但气相色谱法在血药浓度监测上应用相对较少。目前，Rani等［8］研究出一种新型的微填料吸附剂－GC程序，可以成功应用于4种抗癫痫药物（奥卡西平、卡马西平、苯妥英、阿普唑仑）的单独或联合用药监测，且检出限与相似方法相比，表现出更高的灵敏度。该微填料吸附剂的使用也让GC变得更简单、准确、灵敏，将成为以后癫痫治疗联合用药监测的趋势。最近研究出新的萃取方法用于监测地昔帕明（丙咪嗪的代谢物）［9］，也使GC法打破局限，有广泛应用的可能。2．2．3HPLC法该方法检测灵敏度、精密度、特异度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。但这种方法对样品的前处理要求非常高，主要是因为色谱柱作为分离、分析样品的重要载体，对进行分析的样品纯净度要求非常高，大分子蛋白质及其他大分子物质必须处理完全，以最大程度减少对分析柱的柱效影响，延长色谱柱的使用时间。HPLC操作费时，费用相对较高［10］。流动相消耗大且有毒性的居多。目前HPLC方法应用的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。高效液相色谱联合质谱法（HPLC－MS）目前在药代动力学研究上应用较多［11－12］，但其费用高、所需时间较长。目前国外已将人类血浆中药物监测由HPLC－MS转移到超高效液相色谱串联质谱法（uHPLC－MS／MS）上来［13－14］，并对该方法的准确度和精密度进行了验证，结果令人满意，该验证的uHPLC－MS／MS法所需血浆标本量减少，标本制备得以简化，并且在大大缩短运行时间的基础上提高了灵敏度和特异度［14］。如今，研究人员在HPLC－MS的基础上，整体式柱的使用比C18柱的灵敏度和分辨率更高［15］；电喷雾离子化（ESI）的增加使前处理更加容易、耗时减少，均逐渐弥补该法耗时较长、易交叉污染等弊端［16－17］。HPLC－UV就是利用HPLC将样品成分分离纯化、再利用UV进行检测。对于紫外光有特殊吸收峰的药品来说，该方法综合了HPLC与UV的2种优势，且比MS成本低，并且克服了UV法对于多个成分混合样品不易分离、定量，专属性较差的弱点。相比质谱仪的高昂价格，该方法更利于临床推广。且经过验证，其精密度、准确度都在可接受范围，适合用于TDM［18－20］。同时，定量方法也不拘泥于UV，也可使用荧光来进行检测［21］。另外，目前发展较快的高效毛细管电泳法（HPCE）与HPLC比较，其相同处在于都是高效分离技术，仪器操作均可自动化，且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：（1）CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，CE的分析时间通常不超过30min，比HPLC速度快；HPLC分离存在两相（流动相和固定相），电泳是均相。（2）对CE而言，理论塔板高度和溶质的扩散系数呈正比，对扩散系数小的生物大分子而言，其柱效高。（3）CE所需样品为nL级，最低可达270fL，流动相用量也只需几毫升，而HPLC所需样品为μL级，流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量制备。由于其高效分离技术和高灵敏度，在药物分析和体内药物分析中逐渐受到重视，但总体来讲，由于其致命缺点－－重现性差，应用于临床血药浓度监测方面的报道较少。
2．3免疫分析法
免疫分析法包括放射免疫法（RIA）、酶放大免疫法（EMIT）、微粒子酶免疫法（MEIA）、免疫比浊法和荧光偏振免疫分析法（FPIA）等。据以往文献报道，FPIA法较其他免疫法使用广泛，但不及HPLC法。但因免疫法样品处理简单，所需时间短，已成为TDM不可或缺的方法之一，且便于在临床应用推广。2．3．1RIARIA虽然有灵敏、特异、简便易行、用样量少等优点，在早些年基层医院应用较广［22］。但是由于其包含生物制剂稳定性受影响，且存在放射线辐射和污染等问题，近年来基本很少用于血药浓度监测。2．3．2EMIT和MEIAEMIT和MEIA均是利用酶的高效性专一性催化底物发生反应产生荧光而定量检测的方法。这种方法简单、精确，可以用于TDM［23］，但是应注意其与FPIA方法的差异并应作出及时调整，且影响酶活性的条件很多，如温度、PH、酶浓度均会对酶促反应造成影响，所以应用该方法时应注意试剂保存［24］。Abbott的MEIA法是专利技术。有文献称，Abbott实验室研究两个新的Architect?系统技术测量地高辛水平，其中Architect?i1000srSystem是基于化学发光微粒子免疫法（CMIA），其测定血清地高辛结果是精确的，但在从临床监测方面来看，其结果与已经得到认可的AbbottAxSYM?MEIA法测定血清地高辛结果比较是相对不精确的，临床不可接受。但在监测肝、肾移植术后血清中依维莫司浓度（使用AbbottIMx?MEIA）时，Abbott基于Architect－i1000?系统的西罗莫司CMIA法，被认为是可能成为一种有效替代其他常规免疫治疗监测依维莫司的方法［25］；且西门子医疗诊断有限公司的西罗莫司标记抗体磁性免疫分析法（ACMIA）不需要人工血液样本前处理，缩短操作时间，也可能成为一个可以接受方法［26］。2．3．3免疫比浊法其原理是抗原抗体反应后形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的浓度。但应注意：（1）抗原或抗体量大大过剩，可出现可溶性复合物，造成误差；（2）应维持反应管中抗体蛋白始终过剩；（3）易受到脂血的影响。拜耳的ADVIA1650分析仪应用免疫比浊法监测苯妥英，通过与FPIA法对比得出，该法适用于苯妥英常规监测。2．3．4荧光偏振免疫分析法（FPIA）目前在临床TDM应用较多，由于其简便、快速、特异性强，适用于临床常规分析，尤以其快速更适用于急诊的TDM。AbbottTDx?分析仪经临床评价在校准和试剂稳定性上具有显著优势，低的药物浓度范围内有更高的敏感度，而准确度和精密度更可以与EMIT和RIA媲美。但其存在成本较高、可开展监测的药物种类局限于试剂盒的开发种类等弱势。目前，有学者研究出了基于FPIA的微芯片法用于血药浓度监测，检测时间可在一分钟左右，并且准确度同常规克隆酶供体免疫测定法（CEDIA）、常规颗粒增强比浊抑制免疫分析法（PETINIA）一样，样品检测结果与常规CEDIA、PETINIA法所得结果相比具有良好相关性。将来，更加快速、方便的方法必定成为趋势。
3小结
综上所述，血药浓度监测方法仍以液质联用居多，其分离水平和精确的定量都是其他方法所不能比拟的，在TDM中具有优势。而免疫法，如FPIA、EMIT等也因其快速、精确、灵敏得以在临床应用中推广。而其他方法，如GC、HPCE等，在临床中应用不及上述2种方法。研究趋势表明今后的TDM技术将会向更加快速、便捷、灵敏、精确发展，对仪器及操作人员的要求逐渐降低，使TDM在临床应用更为广泛。
作者：薄娜娜 王倩 刘旭 单位：天津中医药大学第一附属医院检验科 天津医科大学总医院检验科