龙川草骨痛颗粒质量标准论文
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【摘要】目的制定龙川草骨痛颗粒质量控制标准。方法采用薄层色谱法对处方中乳香、没药、延胡索、牛膝、桂枝进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对绿原酸进行含量测定，用以控制其质量。结果HPLC法测定绿原酸可达基线分离，在浓度1.62～21.60μg时线性良好,回归方程:A=2516409C-2979，r=1.0000，5次测定平均加样回收率为98.7%,RSD为2.29%。结论该法可准确地进行定性、定量检测，能有效地控制该制剂的质量。
【关键词】龙川草骨痛颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法；绿原酸
StudyonQualityStandardofLongchuancaogutongGranule
Abstract：ObjectiveToestablishastandardforthequalitycontrolofLongchuancaogutongGranule.MethodsRamulusCinnamomi,RadixAchyranthisBidentatae,RuXiang,MoYaoandRhizomaCorydaliswereidentifiedbyTLC,andthecontrolofChlorogenicacidinCortexEucommiaewasdeterminedbyHPLC.ResultsThecalibrationcurvewaslinearintherangeof1.62～21.60μg(r=1.0000).Theaveragerecoveryofthemethodwas98.7%,RSDwas2.29%(n=5).ConclusionThismethodisreliableandaccurate,andcanbeusedforthequalitycontrolofthispreparation.
Keywords：LongchuancaogutongGranule;TLC;HPLC;Chlorogenicacid
龙川草骨痛颗粒是由杜仲、乳香、没药、延胡索、牛膝、桂枝等15味药材组成的复方制剂。具有补益肝肾、舒筋活络、养血敛阴、止痛消淤等功能，临床上用于治疗腰间盘突出、骨质增生、颈椎病、风湿以及类风湿症，疗效满意。处方中杜仲药材所含的主要成分为绿原酸，绿原酸的含量测定方法，文献报道有薄层扫描法［1］、紫外分光光度法［2］、高效液相色谱法［3］等。本实验采用薄层色谱法对处方中桂枝、牛膝等五味药材进行定性鉴别；采用了检测灵敏度高、准确度及精密度好的高效液相色谱法，对处方中的绿原酸进行含量测定，用以控制其质量。
1仪器与试药
1.1仪器LC4A高效液相色谱仪；SPD2A紫外检测器；CR3A积分仪；UV260紫外分光光度计（日本岛津制作所）。
1.2试剂与药品甲醇为色谱纯；磷酸、石油醚、醋酸乙酯、氯仿、正己烷等其它试剂均为分析纯。绿原酸对照品（批号7539406中国药品生物制品检定所）。龙川草骨痛颗粒（由沈阳制剂中心提供，批号20010612，20020620，20020623，20030314）。
2方法与结果
2.1鉴别
2.1.1桂枝定性鉴别桂枝其有效成分为脂溶性和水溶性两部分，用蒸馏法提取挥发油，以桂皮醛作对照品，参考桂枝薄层色谱鉴别项下的色谱条件进行薄层鉴别，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点，分离效果好，经阴性对照，阴性样品无干扰，证明此方法具专属性与可行性。
对照品溶液制备：取桂皮醛对照品，加乙醇制成每毫升含1μl的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照液制备：取去桂枝的本品细粉5g，加乙醇10ml，浸泡20min，时时振摇，滤过，滤液作为阴性对照液溶液。
供试品溶液制备：取本品细粉5g，加乙醇20ml，加热回流40min，滤过，滤液加入盐酸2ml，加热回流1h，后浓缩至约5ml，加水10ml，用石油醚（60～90℃）20ml提取，提取液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
测定法：照薄层色谱法［4］，吸取供试品溶液、阴性对照液各10μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）∶醋酸乙酯（17∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色斑点。见图1。
2.1.2牛膝定性鉴别牛膝含皂苷和脱皮甾酮、牛膝甾酮、钾盐和黏液质等。有散淤活血、消肿痛、补肝肾、强筋骨、降血压等效用。其有效成分三匝皂苷，水解后皂元齐墩果酸，以齐墩果酸为对照品。使用乙醇，加热回流提取并在盐酸条件下，加热回流将提取物水解，用甲醇制成供试品液，另使用氯仿∶甲醇（40∶1）为展开剂。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，分离效果好，经阴性对照，阴性样品无干扰，证明此方法具专属性与可行性。
对照品溶液制备：取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照液制备：取去牛膝的本品细粉5g，按供试品制备方法，依法操作，作为阴性对照液溶液。
供试品溶液制备：取本品细粉5g，加乙醇20ml，加热回流40min，滤过，滤液加入盐酸2ml，加热回流1h，后浓缩至约5ml，加水10ml，用石油醚（60～90℃）20ml提取，提取液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
测定法：照薄层色谱法［4］，吸取供试品溶液10～15μl、对照品溶液2μl，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以氯仿：甲醇（40∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色斑点。见图2。
2.1.3乳香定性鉴别乳香中含树脂、树胶、挥发油。树脂的主要成分为游离α、β-乳香脂酸、结合乳香脂酸、乳香树脂烃；树胶含阿糖酸、西黄芪胶粘素；挥发油呈淡黄色，有芳香，含蒎烯、消旋柠檬烯及α、β-水芹烯。采用水蒸气蒸馏收集挥发油，以药材作对照，以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）为展开剂，进行二次展开，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，分离效果好，经阴性对照，阴性样品无干扰，证明此方法具专属性与可行性。
对照品溶液制备：取乳香对照药材0.5g，加乙醇10ml，超声处理5min，滤过，滤液作为对照品溶液。
阴性对照液制备：取去乳香的本品细粉5g，按供试品制备方法，依法操作，作为阴性对照液溶液。
供试品溶液制备：取本品细粉10g，加乙醇10ml，超声处理5min，滤过，滤液作为供试品溶液。
测定法：照薄层色谱法［4］，吸取供试品溶液10～15μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）∶醋酸乙酯（85∶5）为展开剂，展开3cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，以碘蒸气熏至斑点显色清晰。日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图3。
图1桂枝的薄层色谱图（略）
图2牛膝的薄层色谱图（略）
图3乳香的薄层色谱图（略）
2.1.4没药定性鉴别没药中含树脂、树胶、挥发油。树脂的主要成分大部分为脂溶性，小部分为水溶性，含α，β-罕没药酸，没药尼酸，α，β-罕没药酚；挥发油在空气中易树脂化，含丁香油酚、枯醛、蒎烯、桂皮醛等；树胶水解得阿拉伯糖、半乳糖和木糖。采用水蒸气蒸馏收集挥发油，以药材作对照，以石油醚（60～90℃）∶醋酸乙酯（85∶5）为展开剂，进行二次展开，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，分离效果好，经阴性对照，阴性样品无干扰，证明此方法具专属性与可行性。
对照品溶液制备：取没药对照药材0.5g，加乙醇10ml，超声处理5min，滤过，滤液作为对照品溶液。
阴性对照液制备：取去没药的本品细粉5g，按供试品制备方法，依法操作，作为阴性对照液溶液。
供试品溶液制备：取本品细粉10g，加乙醇10ml，超声处理5min，滤过，滤液作为供试品溶液。
测定法：照薄层色谱法［4］，吸取供试品溶液10～15μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）为展开剂，展开3cm，取出，晾干，再以石油醚（60～90℃）：醋酸乙酯（85∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，以碘蒸气熏至斑点显色清晰。日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图4。
2.1.5延胡索薄层色谱鉴别延胡索主要含生物碱，有延胡索甲素、乙素、丙素、丑素等。药理实验已证明，均有显著的镇痛、安定作用。有行气活血、散淤止痛之功效。用于心腹腰膝诸痛、跌打损伤、淤血作痛等症。以延胡索药材为对照，使用氯仿提取，用甲醇制成供试品液，另使用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，以正己烷∶氯仿∶甲醇（7.5∶4∶1）为展开剂。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，分离效果好，经阴性对照，阴性样品无干扰，证明此方法具专属性与可行性。
对照品溶液制备：取延胡索对照药材0.5g，按供试品制备方法，依法操作，作为对照品溶液。
阴性对照液制备：取去延胡索的本品细粉5g，按供试品制备方法，依法操作，作为阴性对照液溶液。
供试品溶液制备：取本品细粉5g，加氯仿30ml，浓氨试液1ml，超声处理30min，滤过，用硫酸（310）提取2次，15ml/次，合并酸提取液，用浓氨试液调pH9～10滤液作为供试品溶液。用氯仿提取2次，10ml/次，合并氯仿提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
测定法：照薄层色谱法［4］，吸取供试品溶液10～15μl、对照药材溶液2μl，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正己烷∶氯仿∶甲醇（7.5∶4∶1）为展开剂，置已用展开剂饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，以碘蒸气熏至斑点显色清晰。日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。在空气中挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图5。
图4没药的薄层色谱图（略）
图5延胡索的薄层色谱图（略）
2.2龙川草骨痛颗粒中杜仲所含绿原酸的含量测定
2.2.1色谱分析条件
测定波长选择：取绿原酸对照品，加50%甲醇溶解，制成每毫升含10μg的溶液,紫外分光光度法扫描，光谱见图6。从图6中看出绿原酸在321nm处有最大吸收，故选择321nm为测定波长。
图6绿原酸对照品UV图谱（略）
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18柱（4.6mm×250mm,7μm）；流速1ml/min；柱温28℃;进样量20μl。
流动相的选择：参照有关文献，选择甲醇-0.4%磷酸溶液(15∶85)为流动相，保留时间约为17min。
对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品5mg（实际称样为5.4mg）,置100ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声波处理10min，使对照品溶解，再加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（54μg/ml）。
供试品溶液的制备：取本品装量差异项下的粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入氯仿液30ml，超声处理2次，30min/次,弃去氯仿液，挥干，加甲醇30ml，超声处理2次，30min/次,合并甲醇液，蒸干，残渣加50%甲醇溶解，转移至10ml量瓶内，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2.2方法学考察
空白实验：按处方量制备缺杜仲的阴性对照溶液，照文中所述含量测定方法操作，结果空白溶液与绿原酸对照品相同保留时间处，未显示明显色谱峰，认为无干扰，见图7。
图7龙川草骨痛颗粒的HPLC图（略）
样品溶液稳定性实验：将待测样品溶液，置室温下贮存，分别于0，0.5，1，2，3，5h,定期测定含量。结果6次含量的RSD为0.48%,表明样品溶液基本稳定。
仪器的精密度实验：精密吸取上述对照品溶液（54μg/ml）20μl，重复进样6次，结果RSD为0.41%，精密度实验符合要求。
重复性实验：取同一批号的供试品，分别进行供试品溶液的制备、测定，重复5次，结果RSD为1.34%。
线性关系的考察：精密量取绿原酸对照品溶液0.30，0.50，1.00，1.50，2.00和4.00ml，分别置于10ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀。取20μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，进行线性回归，线性方程：A=2516409C-2979，r=1.0000。
加样回收率实验：精密称取已知含量的同一批龙川草骨痛颗粒（20010612）1g,精确加入绿原酸对照品适量,按文中供试品溶液的制备方法操作,测定其含量,并计算回收率。结果见表1。
表1加样回收率实验（略）
2.2.3样品测定取本品装量差异项下的粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入氯仿液30ml，超声处理2次，30min/次,弃去氯仿液，挥干，加甲醇30ml，超声处理2次，30min/次,合并甲醇液，蒸干，残渣加50%甲醇溶解，转移至10ml量瓶内，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。精密称取绿原酸对照品5mg,置100ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声波处理10min，使对照品溶解，再加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
本品每袋含杜仲以绿原酸（C16H18O9）计，不得少于1mg。
取本品样品3批，按上法测定。结果见表2。
表2龙川草骨痛颗粒样品测定结果（略）
3讨论
3.1提取方法、提取溶剂的选择分别选用甲醇、乙醇为提取溶剂，超声波处理30min，结果甲醇提取量大于乙醇。因此选择甲醇为提取溶剂。
3.2色谱条件的选择在本项实验中，我们参考文献，采用了甲醇与磷酸水的配比，而没有采用缓冲液作为流动相，有利于色谱柱的长期使用。
【参考文献】
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