血脂相关影响N素与广西壮族人群泌尿系结石关系研究
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[摘要]目的 探讨血脂相关影响因素与广西壮族泌尿系结石的相关性。方法 分别选取来院就诊的120例壮族泌尿系结石患者与120例壮族体检正常者列为结石组和对照组，采集两组受检者空腹静脉血液3～5 ml，分离血清后采用日立7600全自动生化分析仪进行总胆固醇（Tc）、血三酰甘油（TG）、血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和血浆载脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）测定。分析两组人群血脂相关因素及家族史差异.并用PCR-测序技术检测两组人群的ApoE基因序列。结果 两组人群TG、TC、HDL-C和血浆ApoE比较差异有统计学意义（P
泌尿系结石是泌尿外科最常见的疾病，在广西壮族人群中发病率较高。泌尿系结石成因复杂，与很多因素均有关系，如遗传、解剖、环境、性别、代谢等。其中血脂异常与泌尿系结石的关系在过去未受重视.但近年来越来越多的研究结果表明血脂异常与泌尿系结石发病密切相关。在遗传研究方面，肾结石双生子对照研究揭示了其遗传度为52%-56%，反映了遗传在泌尿系结石形成中的重要作用。本研究探讨了血脂水平对广西壮族人群泌尿系结石的影响，并研究了部分遗传病因。
1.资料与方法
1.1一般资料 结石组的纳入标准：（1）经x射线、B超、CT等影像学检查确诊泌尿系结石；（2）父母皆为壮族，且居住本地10年以上。排除标准：（1）患有尿路畸形、尿路感染等泌尿系统疾病；（2）胃、肠等消化道功能疾病患者；（3）存在肾衰、肾功能不全等症。共选人120例泌尿系结石患者参与本次研究，男性83例.女性37例；年龄11-73岁，平均（41.0_+10.5）岁。其中上尿路结石82例，占68.3%；下尿路结石17例，占14.2%；复合型结石21例，占17.5%。同时选取同期体检正常且无泌尿系结石病史的120名正常者，纳人对照组。对照组男性79例，女性41例；年龄10-70岁，平均（39.0±10.6）岁。对照组的选择也均为壮族人群，并保证了两组人群在年龄、性别方面差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2实验仪器 Hitachi7600型全自动生化分析仪（日立，日本），Verity 96well PCR仪、Gene Genius凝胶成像仪（syngene，英国），3730XL测序仪（ABI，美国），HC-2518R冷冻离心机（BBI，加拿大），TGL-14G_式高速离心机（上海医疗器械有限公司），DYY-8C电泳仪（北京六一仪器厂），H6-1电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂），XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），HS-800D数显恒温水浴锅（芜湖金瑞特计量检测仪器有限公司），SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂），100-1000 ml、20-200 ml、0.5-10 ml、0.1-0.25 ml移液器（BBI公司，加拿大）。
1.3实验试剂 引物、Pfu DNA Polymerase高温聚合酶、MgCl，（25 mM）、10×PCR Buffer、dNTP（10mM）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE、PCR产物纯化回收试剂盒、无乙水醇、异丙醇、丙三醇、DNA提取试剂盒。
1.4检查及分析方法
1.4.1血脂检查 采集受检者空腹静脉血液3-5 ml，分离血清后采用日立7600全自动生化分析仪进行总胆固醇（TC）、血三酰甘油（TG）、血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和血浆载脂蛋白A、B、E（ApoA、ApoB、ApoE）测定。
1.4.2DNA提取 将分离所剩血液按DNA提取试剂盒操作.提取出的DNA经紫外分光光度计检测浓度与纯度，达到标准后放置200C冰箱保存。
1.4.3PCR扩增及基因测序 ApoE三个外显子引物分别为：1F 5’-CTCTATGCCCCACCTCCTF-3’：1R5’-CCCCGAGTAGCTCTCCTGA-3’：2F 5’-AACAAG-GCTFGGAAGGCTA-3’：2R 5’-CAGCACAGAAGCCT-CAGAAGA-3’；3F 5’-CTCACCCTGCCCACCAT-3’；3R 5’-CAGGCCCCCCAAGACTT-3’。PCR反应体系为：1 uL模板，0.5 uL引物F，0.5 uL引物R，0.5 uLdNTP 10 mM，2.5 uL Taq Buffer，0.2 uL Taq酶（5 U/IxL），20 uL水。PCR反应条件为：95～C预变性3min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s至60 s，经35个循环后在72℃下延伸10 min。所得产物经1.5%TAE琼脂糖电泳，以确定PCR扩增是否有效，电泳条件为150 V、100 mA 20 min。PCR产物纯化回收试剂盒，于测序仪上完成测序（此步骤由上海生工生物工程股份有限公司完成）。
1.5统计学方法 使用SPSS 17.0进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较采用两独立样本t检验.计数资料用百分率表示，组间比较采用x2检验，检验水准：a=0.05，双侧检验。
2.结果
2.1两组血脂及相关指标的比较 两组人群TG、TC、HDL-C和血浆ApoE比较差异有统计学意义（P
2.2两组人群家族史对比 结石组有家族史33人，占27.5%（33/120），对照组有家族史14人，占11.7%（14/120），两组比较差异有统计学意义（x2=9.551，P=0.002，OR=2.87，95%CI：1.45-5.71）。即结石组相较于对照组，其家族中一级亲属患泌尿系结石的风险更高.有家族史人群比没有家族史人群更易患泌尿系结石。
2.3两组人群ApoE基因对比 对240个样本ApoE基因的三个外显子进行PCR后测序，结果显示，结石组和对照组的碱基序列均无突变。将所得序列与NCBI公布的ApoE序列对比.并未发现差异。PCR后电泳结果见图1，测序结果见图2。
3.讨论
泌尿系结石的发病率与复发率均较高，给患者增加经济负担的同时，也让患者承受了极大的痛苦，因此，明确其病因尤为重要。尿路结石病因复杂，可能涉及代谢、解剖、感染、环境、社会、遗传、饮食等多个方面。其中，血脂代谢与泌尿系结石的相关性研究已取得一定的进展.但研究结果并不完全一致。国外Masterson等通过泌尿系结石患者大样本回访研究，认为血脂谱中高TG、LDL-C水平与泌尿系结石的发生不相关，仅HDL-C水平降低与之有关。国内柴东岳等通过结石组与对照组为1：2配比的φ昭芯浚认为高TC、TG、LDL-C、低HDL-C水平与泌尿系结石显著相关，并且低HDL-C血症和高LDL-C血症是上尿路结石患者发病的独立危险因素。因此本研究在广西壮族人群中进行血脂与泌尿系结石的相关性研究，并加入了载脂蛋白的因素，结果显示，高TC、TG、ApoE水平及低HDL-C水平与泌尿系结石的产生相关，而LDL-C、ApoA、ApoB水平与泌尿系结石不相关。
几乎所有研究均确认了低HDL水平与泌尿系结石的关系。低HDL-C引起泌尿系结石的原因，可能是结石患者存在逆向转运胆固醇功能障碍.导致流人肝脏的游离脂肪酸减少，流人肾脏等肝外器官的游离脂肪酸增加.然后从以下几个方面导致结石形成：血脂升高产生的氧化应激，导致肾小管上皮细胞的损害成为尿路结石形成的起始环节：脂类排泄增多参与结石形成，其中糖脂是结石的主要脂类：肾小管的脂肪浸润引起Na+/H+交换体（NHE3）减少，尿液酸化，从而诱发草酸钙、尿酸盐结晶的形成。此外，也有研究者认为，进入肾脏的游离脂肪酸增加会引起NADP-NADPH介导的5-磷酸核糖向磷酸核糖焦磷酸的嘌呤从头合成亢进，引起尿酸生成增加，并且TG降解生成的部分游离脂肪酸再酯化进人其他组织的过程，也会使尿酸生成增加。本次实验中关于TC和LDL-C的结果与部分文献报道不同.可能的原因是决定肾脏脂肪浸润的关键因素在于HDL-C水平，而TC、HDL-C受饮食及肝代谢的影响较大，此外，环境、生活习惯、民族差异也可能对结果存在影响。
载脂蛋白E是一种重要胆固醇载体，在体内起到运输脂类及胆固醇的作用。本实验发现结石组中载脂蛋白E和TC的水平要高于对照组，差异有统计学意义，提示进入肾脏的胆固醇增多与结石的形成有关。有研究提示胆固醇具有促进结石成核作用，并且胆固醇在血管和内皮下沉积过多，会致使滤过膜屏障损坏，其具体的分子生物学机制，有待进一步研究证实。
本实验显示，泌尿系结石患者家族中一级亲属患泌尿系结石的风险更高，有家族史人群比没有家族史人群更易患泌尿系结石，说明了遗传在结石发病中的重要作用。近年已发现很多基因与泌尿系结石存在关系，其中研究较多的是OPN基因、Klotho基因和VDR基因，而关于载脂蛋白E与泌尿系结石的关系研究较少。载脂蛋白E与血脂代谢的关系毋庸置疑，血脂异常又与泌尿系结石关系紧密，故我们推测载脂蛋白E的基因多态性与泌尿系结石存在一定的关系。Qian等在维吾尔族人群中发现载脂蛋白E的E3/4和E4分别为泌尿系结石患者的易感基因型和易感等位基因。但是本次实验在广西壮族人群中未发现与泌尿系结石相关的ApoE基因突变点，这似与Qian等的结论存在差异。有两种可能，其一E4突变点可能位于第四外显子和非编码序列上；其二，这种差异可能为种族和地域差异所致。
综上所述.血甘油三酯、总胆固醇与广西壮族人群泌尿系结石的产生存在一定的关系.是否可以通过控制上述临床指标促进结石的清除、降低复发的风险，有待下一步大样本临床研究和基础机制研究。基因筛查对一些复发性结石确有一定诊断意义，并根据病因合理指导治疗。但我们并未在载脂蛋白E基因的前三个外显子上发现如Qian所报道的基因突变，对于基因筛查指标的选择仍需要大量的实验研究。