鱼卵蛋白酶抑制能力与其应用前景

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蛋白酶抑制剂泛指具有抑制蛋白酶活性作用的一类物质，在动物、植物、微生物中广泛存在，能与体内参与各种调控作用的蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命过程。蛋白酶抑制剂具有多种生物活性，很多蛋白酶抑制剂已被开发为新药，广泛应用于临床上［1］。根据蛋白酶抑制剂的一级结构、三维模型和作用机制，可将其分为至少18个家族［2］。蛋白酶抑制剂作为调节者，在生物体内一系列的生理作用中起着重要作用［3］。在脊椎动物体内，与血液凝固，纤维蛋白溶解作用，癌症，补体激活有关［4－6］。在非脊椎动物的免疫中［7－8］，能调节蛋白酶活性包括血淋巴凝集，酚氧化酶活性，细胞活素类和抗菌肽的合成［9－11］。由于外源性蛋白酶是重要的病原因子［12］，许多蛋白酶抑制剂能直接抑制病原生物的外源性蛋白酶的水解作用，起到病害防御作用。研究表明，鱼卵中存在着种类丰富的蛋白酶抑制剂成分，在鱼卵中除执行生理调节功能外，在病原生物防御中也起到了重要作用［13－15］。然而，截止目前，只对少数鱼卵中的蛋白酶抑制剂进行了研究，有关鱼卵自身的防御机制依然存疑。因此，对其研究，既可进一步探讨其生理、防御功能，又可为其在食品医药等领域的利用提供基础数据。鱼卵作为一种水产资源，其综合利用潜力有待进一步开发，以提高其附加值。因此，笔者检测了4种常见养殖鱼类的鱼卵对胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的抑制活性，研究了部分理化性质，为进一步利用鱼卵和探讨鱼卵自身防御机制提供基础资料。

1　材料与方法

1．1　试验鱼

沙塘鳢（Odontobus　obscurus）0．3～0．5kg，鲫鱼（Carassius　auratus）0．3～0．5kg，草鱼（Cteno－pharyngodon　idellus）0．5～1．0kg，乌鳢（Channaargus）0．5～1．0kg，全部为性成熟雌体。均购自常熟市花园浜农贸市场。

1．2　试剂及仪器

胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶购自Sigma公司。发色底物Nα－Benzoyl－L－arginine　4－nitroanilide　hydrochloride（B－3133）、N－Succinyl－Ala－Ala－Ala－pNA（S－4760）、N－CBZ－Gly－Gly－Leu－pNA（C－3022）、N－Benzoyl－L－tyro－sine　ethyl　ester（BTEE）购自Sigma公司，其他试剂均为分析纯，符合试验要求。TU－1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析生物公司）；高速冷冻离心机（Eppendorf）；冷冻干燥离心机。

1．3　方法

1．3．1　样品制备

活鱼用水清洗干净，由腹腔中取出鱼卵，去掉血污用清水冲洗干净，加适量纯水后，用研钵研磨至匀浆，10　000r／min，4 ℃离心30min，收集上清液，以上步骤重复3次，合并上清液，冷冻备用。用0．1mol／L磷酸氢盐缓冲溶液（pH6．0），将冻干粉溶解于适量的0．1mol／L磷酸氢盐缓冲溶液中，10000r／min，4℃离心30min，取上清液上样于处理好的EP管中备用。

1．3．2　鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性检测及最小抑制质量浓度的测定

在50 mmol／L　Tris－HCl缓 冲 溶 液 （含 有1mmol／L　CaCl2），pH　7．8的反应体系中，于25℃测定待测样品对丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水解生色底物的抑制影响。对枯草杆菌蛋白酶水解生色底物的抑制影响于50mmol／L　Tris－HCl缓冲溶液（含1mmol／L　CaCl2），pH　8．45的反应体系中进行。将不同量的待测样品（终质量浓度2．5～50mg／mL）与蛋白酶（胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶质量浓度均为2mg／mL）于25 ℃保温15min，加入质量浓度为1mg／mL的底物（胰凝乳蛋白酶底物质量浓度为5mg／mL）起始反应。B－3133为胰蛋白酶底物，S－4760为弹性蛋白酶底物，C－3022为枯草杆菌蛋白酶底物。连续2min于410nm处监测光吸收的变化。BTEE作为胰凝乳蛋白酶底物，于253nm处监测光吸收的变化。4种鱼卵对胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的最小抑制质量浓度的测定方法同上。以抑制剂剩余酶活力百分比为纵坐标，抑制剂质量浓度为横坐标作图。对照组只加蛋白酶不加入样品，以对照活力为100％，剩余酶活力百分比按下式计算：剩余酶活力百分比／％＝1－（1－AiA0）×100％式中，Ai和A0分别表示加入和未加入抑制剂时的吸光值。

1．3．3　鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂的热稳定性及酸碱稳定性检测

1．3．3．1　热稳定性

鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂终质量浓度为50mg／mL的样品溶液于30、40、50、60、70、80、90、100℃加热10min，取出后立即放于冰上冷却，然后用检测抑制剂活性的方法测定处理样品的抑制活性。

1．3．3．2　酸碱稳定性

将鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂终质量浓度50mg／mL的样品溶液与等体积的pH　2～11的各种缓冲溶液（0．2mol／L氨基乙酸－HCl缓冲溶液，pH　2、3；0．2mol／L乙酸－乙酸钠缓冲溶液，pH　4、5；0．2mol／L磷酸氢盐缓冲溶液，pH　6、7、8；0．2mol／L氨基乙酸－NaOH缓冲溶液，pH　9、10、11）混合，4℃放置18h，然后用0．4mol／L　Tris－HCl缓冲溶液，pH　7．8调整抑制剂混合溶液的pH值为7．8，并测定其抑制剂活性。

2　结果与分析

2．1　鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性及最小抑制质量浓度

4种鱼卵中存在有效的丝氨酸蛋白酶抑制剂，且均能不同程度地抑制胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶水解底物的活性（图1），胰蛋白酶抑制活性为乌鳢＞草鱼＞沙塘鳢＞鲫鱼；弹性蛋白酶抑制活性为沙塘鳢＞鲫鱼＞草鱼＞乌鳢；枯草杆菌蛋白酶抑制活性为沙塘鳢＞鲫鱼＞草鱼＞乌鳢。经显著差异性分析，这4种丝氨酸蛋白酶中，乌鳢对胰蛋白酶抑制活性极显著高于沙塘鳢和鲫鱼（P＜0．01），显著高于草鱼（P＜0．05）；沙塘鳢对弹性蛋白酶抑制活性极显著高于其他3种鱼类（P＜0．01）；沙塘鳢和鲫鱼对枯草杆菌蛋白酶抑制活性极显著高于草鱼和乌鳢（P＜0．01）（表1）。但对于胰凝乳蛋白酶，除乌鳢表现出明显抑制作用外，其他3种鱼卵即使质量浓度达到50mg／mL时，对凝乳蛋白酶的抑制作用仍不明显。鲫鱼卵对枯草杆菌蛋白酶水解底物活性的抑制曲线见图2。由图2可见，在2min内由410nm处的吸光值可以看出，抑制活性随着抑制剂质量浓度的升高而加强。随着抑制剂质量浓度的逐渐增加，4种蛋白酶剩余活力百分比的逐渐降低，由此可推算出几种鱼卵的最小抑制质量浓度（图3）。由图3可见，乌鳢卵的质量浓度约达3mg／mL时，可将酶的活力抑制到50％以下。

2．2　鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂的热稳定性及酸碱稳定性

温度及pH对抑制剂活性的检测结果见图4。由图4可见，温度为30～100 ℃时，鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂能抑制蛋白酶对特异性底物的水解活性，即使温度高达100 ℃，仍能保持80％以上的抑制剂活性。在pH为2～11时，抑制剂活性始终保持在85％以上。表明鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂均具有很强的热稳定性及酸碱稳定性。

3　讨论

3．1　抑制剂对侵入机制的影响及P1位点作用的探讨

有研究证明，鱼卵表面病原性细菌增长与繁殖依赖于蛋白水解酶的侵入机制［16］。通常宿主的第一道抵御病原微生物攻击的防线是皮肤及消化、呼吸、排泄、生殖系统的表面黏膜系统。外源性蛋白酶是病原性细菌为适应宿主自身防御，首先依附于宿主后通过蛋白酶水解作用渗透进上皮细胞，侵入宿主免疫防御系统所分泌出的重要病原因子。通过水解宿主体内蛋白，其可获得生长和繁殖所需营养物质。这些蛋白酶在宿主表面有相应受体，以利于细菌的生存和侵入［17］。蛋白酶抑制剂能将与病原微生物有关的蛋白酶作为靶酶捕捉，使其钝化然后清除。鱼类病原体如气单胞菌（Aeromonas）、弧43第1期 郭　强等：四种常见鱼卵对丝氨酸蛋白酶抑制活性的比较菌（Vibrio）产生并释放多种胞外毒素（如溶血素，细胞毒系，肠毒素）或酶（如蛋白酶和磷脂酶）等致病因子［18－20］，破坏鱼类的防御系统。本试验通过4种鱼卵对丝氨酸蛋白酶水解活性抑制作用的比较，可以肯定鱼卵中确实存在有效的丝氨酸蛋白酶抑制剂，为进一步研究鱼卵自身防御机制提供了依据。抑制剂活性检测表明，4种鱼卵中均含有能抑制4种蛋白酶活性的抑制剂成分，但对不同的蛋白酶，其抑制活性不尽相同。大量的蛋白酶抑制剂活性检测表明，酶与抑制剂的相互作用主要是由P1位点残基来完成。抑制剂的P1残基为赖氨酸、精氨酸时，对胰蛋白酶和类胰蛋白酶有显著的抑制作用，而P1残基为脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸时，能抑制胰凝乳蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶，P1残基为丙氨酸、丝氨酸时，却能抑制类弹性蛋白酶［21］。这就解释了为何4种鱼卵对不同类型的丝氨酸蛋白酶的抑制能力有差异。在对胰凝乳蛋白酶的抑制活性检测中，发现除乌鳢外其他3种鱼均只有微弱的抑制作用，可能是因为P1位点的残基不能占据胰凝乳蛋白酶作用位点的缘故。

3．2　应用前景展望

据相关文献报道，在鱼类的肌肉组织中存在着内源性丝氨酸蛋白酶［22］，能够降解构成细胞支架的网状结构和肌原纤维蛋白。尤其是在鱼肉食品加工过程中，由于它的存在而出现凝胶劣化现象，影响鱼类食品的口感和质量。而热稳定与酸碱稳定性测试结果表明，鱼卵中所存在的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有耐高温、耐酸碱的特性，如果能将其所含的蛋白酶抑制剂分离纯化得到纯品，加工成食品添加剂，这对改善鱼类食品质量有良好作用。此外，某些蛋白酶抑制剂也正成为治疗一些临床疾病的候选药物，如唾液中的一种蛋白酶抑制剂（SLP1）对艾滋病毒有良好的抑制作用［23］，因此其在临床用药上的广阔前景也令人期待。而更进一步的研究，则需要运用分离纯化技术得到纯品，才能更深入了解在丝氨酸蛋白酶－抑制剂的相互作用中抑制剂所起到的作用。