深究激素对小鼠胚胎体外生长的意义
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早期胚胎体外培养技术在发育生物学、胚胎移植、转基因动物等领域的研究工作中都有很重要的作用。早期胚胎发育是一个复杂的过程,在此过程中,可受到各种激素的影响,激素通过不同途径来调控早期胚胎发育。目前,在不孕治疗中经常使用到各种促排卵激素,在孕妇妊娠期间也经常使用一些激素类药物,有报道,使用不同剂量和不同种类的激素,可能影响到胚胎的质量。另外,环境中也存在着多种激素的类似物,这些激素和激素类似物对胚胎发育的影响研究,目前还缺乏系统性,尤其是较高浓度的激素水平如何影响胚胎的发育、胚胎发育与激素的浓度之间是否存在着剂量依存性、同种激素对不同发育阶段的胚胎的影响等,这些都还不十分明了,很有必要进行深入的研究。本研究旨在以小鼠为试验动物模型,在基础胚胎发育培养液中分别加入不同种类和不同浓度的激素,以探讨其对鼠早期胚胎体外发育的影响机理。
1材料与方法
1.1试验试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)购自宁波第二激素厂,HTF培养液购于美国In-Vitro公司,透明质酸酶购自Vitrolife公司,BSA粉剂购自BovomaX公司,FBS(胎牛血清)购自Gibco公司。胚胎操作液配制:CZB-HEPES(NaCl为478.9mg/100mL,KCl为36.3mg/100mL,KH2PO4为15.9mg/100mL,MgSO4为14.195mg/100mL,NaHCO3为210.0mg/100mL,C6H12O6为100.0mg/100mL,CaCl2?2H2O为25.0mg/100mL,乳酸钠(60%糖浆)为370mg/100mL,链霉素为50mg/100mL,青霉素为60mg/100mL,HEPES为238.0mg/100mL)。使用时,添加BSA粉剂4mg/mL,过滤除菌,使用前加温,用于体外胚胎的收集和清洗操作。
1.2试验动物及处理
昆明品系性成熟小鼠,6～8周龄,购自浙江中医药大学动物实验中心,饲养于光照控制(10L∶14D)、恒温恒湿的饲养室,自由采食饮水。雌鼠于17∶30左右腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(PMSG),48h后腹腔注射10IU人绒毛膜促性腺激素(HCG),HCG注射后与正常雄鼠按1∶1比例合笼,次日清晨检查有无阴栓。有阴栓者于注射HCG后14～21h采用颈椎脱臼法处死小鼠。
1.3胚胎收集
取出输卵管移入操作液,在体视显微镜下找到输卵管膨大部,划破输卵管膨大部使受精卵(云雾状)游离出来。用枪头吸出卵团,移入含透明质酸酶的液滴中反复吹打,镜下观察,当受精卵游离出来后,用移卵管(自制巴氏管)吸出来移入新液滴内清洗3次,备用。
1.4试验分组与胚胎培养
1.4.1检查通过2-细胞阻滞情况。收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为2组,分别置于HTF+10%FBS和HTF+4mg/mLBSA培养液小滴中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,24h后观察2-细胞发育情况并做好记录。
1.4.2检查培养体系。收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于HTF+10%FBS培养液小滴中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察1次,并记录各发育阶段胚胎数目。
1.4.3激素对胚胎发育的影响。选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于添加100、50、10IU/mL的HCG和100、50、10IU/mLPMSG的HTF+10%FBS培养液中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察发育情况,并记录各发育阶段的胚胎个数。以不添加激素的HTF+10%FBS培养液作为对照组(CK)。
2结果与分析
2.1培养液中添加FBS和BSA检查培养系统突破2-细胞阻滞效果
在试验体系中,分别在HTF培养液中添加胎牛血清-FBS(10%)和牛血清白蛋白-BSA(4mg/mL),检查培养系统能否突破小鼠胚胎发育的2-细胞阻滞情况,结果发现:添加FBS和选购的BSA均可以使原核期胚胎突破2-细胞阻滞,而以添加血清效果较好,在以下的试验中将选择HTF添加血清作为基础培养液。
2.2培养体系检查
应用HTF+FBS培养原核期胚胎,可以平均获得2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚的比例分别为80.3%、78.3%、76.0%、75.5%、68.5%,各发育阶段胚胎个数的具体数值。
2.3小鼠胚胎发育各阶段的显微摄影
培养后每间隔24h,在相差显微镜下观察胚胎的发育情况,并拍照,各发育阶段胚胎的形态。各发育阶段胚胎发育正常,培养系统相对稳定。
2.4激素对小鼠原核胚胎体外发育的影响
不同浓度的激素对小鼠胚胎体外发育的影响结果,添加激素后,各发育阶段胚胎的发育率与对照组相比均有所下降,原核期胚胎的2-细胞发生率与对照组相比有所下降,但未发现浓度依赖性;添加不同浓度的HCG使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段;添加不同浓度的PMSG,囊胚的发育率与对照组之间也存在着显著差异;添加HCG似乎可以降低胚胎异常分裂率,而添加PMSG似乎使异常分裂胚胎的比例升高,具体情况如何还需要深入的研究。
3结论与讨论
胚胎的早期发育过程中,很容易受到激素的影响,在辅助生殖实施过程中,往往需要使用激素进行超数排卵处理,激素对早期胚胎的发育影响研究可以为人类辅助生殖技术提高成功率提供一定的理论基础。近年来,随着动物胚胎工程的发展,试管动物、转基因动物和体细胞核移植动物已相继出现,而生产这些动物的一个关键步骤就是胚胎的体外培养,获得稳定的体外发育率是这些技术广泛推广的基础。
试验发现,应用HTF添加10%血清的培养系统可以很好地支持小鼠胚胎体外发育,使用的系统在多次试验检测过程中相对比较稳定,几次试验培养的原核期(1-细胞期)胚胎可以在体外发生分裂,并可以发育到囊胚阶段。
昆明品系小鼠早期胚胎体外培养中表现出严重2-细胞阻滞现象,应用模拟输卵管培养液添加血清和血清白蛋白的方式可以突破2-细胞阻滞,在本研究中进口血清突破2-细胞阻滞的效果要好于选购的BSA。这可能与血清中含有多种促进胚胎发育的细胞因子有关。
PMSG和HCG这2种激素经常被用于动物的超数排卵。孕马血清促性腺激素(Pregnantmareserumgonadotropin,PMSG)具有体内的FSH和LH的作用,而人绒毛膜促性腺激素(Humanchorionicgonadotropin,HCG)是模拟体内LH的作用,促进黄体发育,FSH和LH二者在体内促进卵泡发育、排卵和黄体发育。HCG由人胎盘和胞体滋养层细胞合成,现已可高度纯化,并可由基因重组生成。自1978年首例经体外受精胚胎植入创造的LouiseBrown诞生后,近10余年来随着ART技术的进展,HCG的临床应用也日益广泛,但其在妊娠早期的功能迄今仍未完全明了。虽然HCG对维持黄体功能是必需的,在不孕症患者诱导排卵出现黄体功能障碍时,重复给予HCG能有效地支持黄体功能[10],但也有HCG溶解黄体的报道,试验表明在大鼠、小鼠、兔和羊于胚胎植入前和植入时,给予1次或多次HCG,会导致产生不同程度的胚胎死亡。特别是最近用促性腺激素诱导排卵,在体内或体外受精治疗不孕症时,常继之出现缩短黄体期致胚胎植入失败、妊娠率降低等现象,其机理也还很少阐明。在程渭玉等的研究中也表明HCG对胚胎的毒性,且存在时间、剂量依赖关系。试验添加不同浓度的HCG使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段的胚胎。
PMSG在母马妊娠38~40d时可以检测出,60d时达到高峰,而在120d时开始下降,170d时下降到检测不出的水平;HCG在非孕妇女处于较低水平,在胚胎发育早期也处于低水平,在妊娠第2周以后显著增加。近来也有学者研究认为胚胎体外发育与激素PMSG、HCG存在关联[13],其他激素也可能影响到胚胎的质量。在辅助生殖和超数排卵过程中,需要使用高浓度的PMSG和HCG,在血中二者的浓度高于正常值。在培养体系中添加高浓度的PMSG和HCG,调查其对早期胚胎发育的影响,研究发现胚胎暴露在高浓度的PMSG和HCG降低了胚胎体外发育到各阶段的比例,尤其是明显降低了囊胚的发生率,而HCG对胚胎体外发育的影响似乎更大。由于所调查的样本还较小,其具体情况和具体机制等尚需要深入研究,下一步将扩大试验次数并深入研究多种激素的联合作用对胚胎体外早期发育的影响。