薄皮甜瓜白啄瓜枯萎病抗性基因Fom-2的同源克隆与表达分析

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摘 要： 枯萎病是甜瓜等瓜类作物的毁灭性病害，Fom-2基因介导了甜瓜抗枯萎病生理小种0和1，抗枯萎病育种是甜瓜等瓜类作物育种的重要目标之一。通过同源克隆方法从薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因fom-2，推定编码1 099个氨基酸，所推定的蛋白质序列经Blast分析与数据库中NBS-LRR类R基因具有较高的同源性。进一步序列分析FOM-2蛋白具有典型的R基因的NB-ARC及SCOP 2个结构功能域。实时荧光定量PCR结果表明，白啄瓜Fom-2基因经枯萎病接种后表达明显上调。白啄瓜Fom-2基因为白啄瓜抗病育种奠定了基础。

关键词： 薄皮甜瓜； 白啄瓜； 枯萎病； Fom-2基因

中图分类号：S652 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－1059－04

Cloning and transcriptional analysis of resistance gene Fom-2 from Cucumis melo ssp. Agrestis Jeffrey

YANG Jia-fu1， ZHAO Xuan2， LIU Ju2， YANG Xiao-dong2， WANG Shi-wei2， YANG Jing-hua2， ZHANG Ming-fang2

（1Vocational College of Science and Technology of Wenzhou， Wenzhou， Zhejiang 325006 China； 2Department of Horticulture， Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310029 China）

Abstract: Fusarium wilt （Fusarium oxysporum f. sp. melonis Snyder and Hansen） is one of destructive disease in melon crop production. Fom-2 gene was genetically identified to control the resistance of races 0 and 1. Resistance to fusarium wilt breeding is one of important targets for melon breeding. In this study， we cloned the Fom-2 gene from Baizhuogua melon （Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey） by using homological cloning method， which was deduced to encode 1099 amino acids and exhibited high similarity to NBS-LRR type of R genes in plant. The deduced FOM-2 protein contained NB-ARC and SCOP typical motifs of R gene. The expression of Fom-2 gene was highly induced after inoculation with fom race 1. In conclusion， the cloning of Fom-2 gene is good for breeding with resistance to fusarium wilt .

Key words: Cucumis melo； Baizhuogua； Fusarium wilt； Fom-2 gene

白啄瓜（Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey）属于薄皮甜瓜类型，是温州地区的特产瓜类作物，在温州地区具有很大的栽培面积，栽培面积常年稳定在600~700 hm2。同时，温州地区还具有接近我国人口最密集的长江三角洲蔬菜瓜果消费市场的区位优势，当天采摘，当天即可送到市场，运输费用低，白啄瓜等薄皮甜瓜生产具有非常强的市场竞争能力。近年来，随着集约化、规模化的栽培，白啄瓜病虫害扩散蔓延十分迅速，对甜瓜产量和品质造成极大的影响，尤其是枯萎病的影响。侵染甜瓜的枯萎病病原菌属于甜瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis Snyder and Hansen）。Risser等[1]认为，可将尖孢镰刀菌甜瓜专化型的病原菌划分为4个生理小种，分别为race 0、 race 1、race 2和race 1， 2；3个抗病基因，分别为Fom-1、Fom-2和Fom-3，其中：Fom-1抗race 0和2，感race 1和race 1， 2；Fom-2抗race 0和1，感race 2和race 1， 2；Fom-3抗race 0， 1和2，感race 1， 2，且都是显性基因[2]。Tarek等[3]根据文库及Wang等[4]得到与Fom-2紧密连锁的分子标记，通过图位克隆方法克隆了基因Fom-2，这是到目前为止，甜瓜中唯一克隆到的抗枯萎病基因。在枯萎病的防治中，使用抗性品种是最有效的方法[5]。目前国外已育成的甜瓜抗性品种主要有：Doublon、Charentais与Hemed（含有Fom-1抗性基因）；CM17-187、Charentais 与Makdimon-1（含有Fom-2抗性基因）；MR-1、Top Mark和Perlita FR（含有Fom-3抗性基因）[1-2， 6-7]。我们通过同源克隆方法从薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2同源序列，为白啄瓜抗枯萎病育种奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

材料采用白啄瓜（Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey）高代自交系，由本课题组提供，试验材料催芽后播种于营养钵中，日光温室常规条件下生长，待3叶一心时用于总RNA提取及枯萎病接种试验。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

总RNA的提取采用Plant Mini RNA Extraction Kit（QIAGEN）提取，提取的总RNA经过RNase-free的DNase消化处理，去除基因组污染，所有操作步骤按照试剂盒说明书进行。提取的总RNA经过甲醛变性电泳及浓度测定。取3 μg总RNA，采用Takara的cDNA第1条链合成试剂盒合成cDNA第1条链，所有操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3 Fom-2基因的克隆

Fom-2基因的克隆采用同源克隆的方法，由于Fom-2基因大约有3 000 bp左右的长度，本研究中采用2次PCR扩增的方法扩增5’及3’端序列，然后拼接在一起。采用的引物分别为：Fom-2-F1 ATGGGTGATTTCCTATGGACT； Fom-2-R1 AATCA ATCGTGCGTAGCTTG；Fom-2-F2 CAAGCTACGCA CGATTGATT；Fom-2-R2 CAAGTGGGGTTGGAGCATAT，所有引物在数据库中进行特异性检测。以cDNA第1条链为模板，PCR反应体系为95 ℃ 3 min，然后35个循环，每个循环中95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min。PCR产物经电泳观察、回收，回收产物连接pMD18-T载体中，热激发转化DH5α大肠杆菌，鉴定阳性克隆，选取3个独立的阳性克隆用于ABI3330上进行序列测定。

1.4 序列分析

序列分析采用NCBI、SWISS、SMART、ProtScale等在线分析及DNAMAN等生物信息学分析工具对核苷酸及蛋白质序列进行分析，进化树构建采用MEG4.0软件Neighbor-Joining方法构建。

1.5 枯萎病接种

甜瓜枯萎病生理小种1悬浮孢子的制备，挑取枯萎病生理小种1的菌种，在PDA培养基上培养3 d之后转接到Bilay培养基上，摇床进行培养（25～28 ℃，100 r・min-1）。培养3 d后经2层纱布过滤后在血球板计数器下检测孢子的数目并根据检测情况用培养基将孢子数目调节到106个・mL-1备用。

枯萎病接种采用苗期伤根法接种枯萎病病菌，待瓜苗长至3~4片真叶时，挖出，经清水洗净后，于孢子悬浮液（孢子悬浮液中含孢子数一般为106 个・mL-1）中浸泡30 min，再植回营养杯培养，10 h后取样，提取总RNA用于后续基因表达研究。

1.6 实时荧光定量PCR分析

定量引物为（Fom-2_QF1： 5’-TATGCTTGCGAATGTCCAAT-3’；Fom-2_QR1：5’-ACAACTCT CGAACGTGTTGC-3’），以甜瓜18S rRNA作为内参基因。应用ABI step one Real-time PCR system实时定量PCR仪，以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为SYBR Green 10 μL，cDNA 2.5 μL，引物0.5 μL，补水至总体积20 μL。反应程序为95 ℃ 10 min，然后40个循环，每个循环中95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，反应完成后，统计数据进行相对定量分析，3次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 白啄瓜Fom-2基因的克隆与序列分析

随着白啄瓜集约化、规模化的生产，尤其是设施白啄瓜的发展，枯萎病的发生越来越严重（图版-A，B），已经成为制约白啄瓜安全绿色生产的限制因素。

我们通过同源克隆方法，从白啄瓜中克隆到了Fom-2基因，cDNA序列的CDS全长为3 300 bp，推定编码1 099个氨基酸，采用在线分析得到FOM-2蛋白的等电点为8.08，分子量为126.96 ku左右（图版-C）。通过SMART在线分析，表明FOM-2蛋白存在2个结构功能域：NB-ARC和SCOP功能域，其中NB-ARC功能域是植物R基因的典型结构功能域，SCOP为富含LRR的结构功能域，对NBS-LRR类R基因的功能十分重要（图版-C，D）。

2.2 白啄瓜Fom-2基因编码蛋白分析

采用ProtScale在线分析（）表明，FOM-2蛋白具有多个高疏水性和亲水性区域（图版-E）。通过SWISS-MODEL分析表明FOM-2蛋白具有典型螺旋及折叠结构，含有一个可能的CC区域，可能属于CC-NBS-LRR类型R基因（图版-F）。

基于白啄瓜推定的氨基酸序列及NCBI数据库中典型的R基因序列，采用MEG4.0软件已邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，表明白啄瓜Fom-2基因与其他物种的NBS-LRR类R基因同源性较高（图1）。

2.3 枯萎病接种后白啄瓜Fom-2基因的表达

采用实时荧光定量PCR方法，对白啄瓜Fom-2基因的表达情况进行了研究，结果表明，白啄瓜Fom-2基因在经甜瓜枯萎病生理小种1接种后表达明显上调，接种后表达水平相对于对照水平上升7倍左右（图2）。

3 讨 论

抗枯萎病育种是甜瓜等瓜类作物的主要育种目标之一，枯萎病抗性基因的克隆为抗病分子育种提供依据。高等植物中广泛存在相对保守的植物抗病基因R基因，其中NBS-LRR（nucleotide binding site-leucine rich repeat）类R基因是数量最多的一类含有核苷酸结合位点及富含亮氨酸重复的胞内受体蛋白[8]。模式植物拟南芥基因组中大约有200个左右的R基因类似序列，但功能已知的只有少数十几个[9]。本研究通过同源克隆方法从薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了抗甜瓜枯萎病生理小种0和1的Fom-2基因的同源基因，从白啄瓜中克隆到的Fom-2基因与NCBI数据库中已注册的NBS-LRR类R基因具有较高同源性，为典型的NBS-LRR类R基因，具有R基因的2个结构功能域NB-ARC及富含LRR域的SCOP结构功能域[8]。目前认为，LRR区域为病原菌的特异识别区域，单核苷酸改变都有可能影响到病原菌的专性识别，LRR区域的专性识别机制是植物抗病基因与病原菌协同进化选择的结果[10]。我们同时也对不同甜瓜变种或栽培种的Fom-2基因LRR区域进行了扩增与分析，发现了LRR区域在不同甜瓜变种或栽培种中存在单核苷酸多态性，我们同时也根据这些单核苷酸多态性位点开发了AS-PCR及CAPS标记，用于甜瓜抗枯萎病分子育种辅助选择[11]。国内有课题组曾从 日本安农二号（Japan annong-2）甜瓜中克隆到了Fom-2基因，同时也研究了几个甜瓜品种中该基因的单核苷酸多态性位点，为甜瓜的抗枯萎病育种提供理论依据[12-13]。然而，目前Fom-2基因介导甜瓜抗甜瓜枯萎病生理小种0和1的机制仍不清晰，FOM-2蛋白的生化机制及LRR区域单核苷酸多态性位点与基因的功能相关性研究目前仍需要进一步深入。随着更多甜瓜Fom-2基因的克隆与分析，大大加快了甜瓜抗枯萎病的分子育种进程。（本文图版见插4）

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