基因枪介导的转基因小麦的获得与鉴定
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摘要：运用基因工程技术将外源抗病基因直接导入具有优良农艺性状的小麦品种中，能够获得抗赤霉病小麦新品种。采用基因枪介导的共转化法，以bar基因为筛选标记，将几丁质酶基因导入长江中下游小麦栽培品种郑麦9023，T0代经过PCR鉴定，获得6株阳性植株，表明几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。
关键词：小麦；赤霉病；基因枪转化；几丁质酶基因
中图分类号：S512.1；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）05-1038-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.05.004
Abstract： Genetic engineering can directly introduce exogenous antifungal genes into elite wheat with to obtain new wheat varieties against FHB （Fusarium Head Blight）. Using bar as selection marker， trichoderma chitinase gene（UEch42） was introduced into immature embryos of Zhengmai 9023 by biolistic co-bombardment. PCR results showed that 6 transgenic plants were obtained in T0 generation， indicating that genes were integrated into wheat genome.
Key words： wheat； FBH （Fusarium Head Blight）； microprojectile bombardment； chitinase gene
小麦赤霉病（Fusarium Head Blight，FHB）是由禾谷镰刀菌引起的禾谷类真菌病害，其致病菌主要在开花灌浆期侵染小麦的穗部，造成穗腐、粒腐，引起减产，甚至颗粒无收。禾谷镰刀菌在侵染小麦的过程中会产生单端孢霉烯族毒素（Trichothecenes，单族毒素），会滞留在子粒上进入食物链，从而引起食品安全问题，危及人畜健康，近年来随着气候的变暖，小麦赤霉病在北美和欧洲大陆也时有大面积发生，这严重影响着小麦生产区的粮食安全。
可是，到目前为止，世界上还没有发现完全抗赤霉病的小麦品种，抗赤霉病育种工作已经开展了很多年，主要集中在传统育种方面[1]，但是传统育种耗时费力，获得的小麦品种抗性单一，抗性遗传基础狭窄[2]，利用转基因技术将赤霉病抗性基因转入小麦栽培品种，丰富小麦中的抗真菌性病害基因，加快育种进程，大大提高育种效率和抗病效果，不失为一种有效获得抗性小麦品种的重要途径。
研究表明，几丁质是一种广泛分布于多数真菌细胞壁上的主要成分。它是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4-糖苷键连接的多聚物。植物中的N-乙酰葡萄糖胺以糖酯键形式存在，而非线性同聚物，即植物中缺少该酶的有效底物。所以几丁质酶可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质，破坏细胞新物质的沉积致使病原体死亡，而且产生的细胞壁碎片具有诱导作用，从而刺激寄主植物的抗病反应。通过基因工程的手段将几丁质酶基因转入小麦中，使小麦获得分泌几丁质酶（Chitinase）的能力。当禾谷镰刀菌入侵小麦时，转基因小麦分泌的几丁质酶可将此真菌的细胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，从而达到抗病的效果。
1992年Vasil等[3]采用基因枪技术获得了第一株转基因小麦，随后，Weeks等[4]利用基因枪技术将 gus和bar基因导入了小麦，建立基因枪转化小麦的技术体系。目前，基因枪转化体系日益成熟，在小麦遗传转化方法中起着举足轻重的作用[5，6]。基因枪法与其他转化方法相比，具有许多优点：受体材料来源广泛，无宿主限制，它避免了原生质体培养再生植株困难的问题以及农杆菌的宿主范围限制；具有可控性高、操作简便、快速、灵活等特点，从而实现多基因共转化[7]。到目前为止，基因枪法运用最小表达框进行小麦遗传转化成为应用最为广泛的方法[8-11]。
本研究采用基因枪共转化的方法，利用bar基因作为筛选标记基因，将含有几丁质酶基因用于基因枪转化，以期获得含有几丁质酶基因的转基因小麦，并探索利用几丁质酶基因改良小麦抗赤霉病性状的可行性，对小麦提高赤霉病抗性研究具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用小麦品种郑麦为9023，质粒为pXJC- ch42、pBar。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基配制 培养基成分参考文献[12]。
1.2.2 外植体选择 取开花后12～14 d的麦穗，剥取麦穗中间部位比较饱满的体被白色绒毛呈嫩绿色的未成熟幼胚，用70%乙醇消毒30 s，无菌水快速冲洗1次，0.1%氯化汞消毒6～8 min，无菌水冲洗3～5次，每次2 min；在无菌条件下剥取半透明状的幼胚，接种于愈伤诱导培养基中，放于27 ℃培养后用于转化，挑选呈淡黄色，颗粒状，较致密的愈伤转至高渗培养基作高渗处理。
1.2.3 基因枪轰击方法与参数 利用Bio-Rad公司生产的PDS-1000型高压氦气基因枪。轰击参数：压力7.58 Mpa，距离 9 cm，真空度93.13 kPa，轰击次数1次，每枪金粉用量为250 μg，DNA用量为 1.5 μg，根据Bio-Rad公司基因枪使用说明书提供的方法轰击，轰击后继续高渗暗处理16 h。
1.2.4 恢复培养及筛选 轰击后的愈伤继续高渗 16～20 h，然后转入恢复培养基于 27 ℃中培养，根据愈伤组织在恢复培养基上生长的状态，愈伤组织快速增殖开始出现大量胚状体的时候，即可转入分化筛选培养基。将恢复后的胚性愈伤组织转入分化筛选培养基，待愈伤分化出抗性绿芽后转入再生筛选培养基，将生长状态良好的绿苗转入生根筛选培养基。将生根筛选后存活的苗转入壮苗培养基中壮苗，随时观察苗的状态。当幼苗明显变绿，根系较发达时即可置于4 ℃春化，移栽至温室。
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