骨髓单个核细胞抗体及外周血B淋巴细胞与IRP的相关性研究

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摘要：采用流式细胞术双标法检测拟诊免疫相关性全血细胞减少症患者（A组）、非免疫相关性恶性血液病患者（B组）及正常人（正常对照组）的骨髓单个核细胞结合的自身抗体.同时检测B组、确诊免疫相关性全血细胞减少症（C组）及正常对照组外周血B淋巴细胞及CD5+B淋巴细胞比率；A组中16例骨髓造血细胞自身抗体阳性，阳性率88.88%；B组1例骨髓造血细胞自身抗体阳性，阳性率9.09%。C组外周血B淋巴细胞CD5+B淋巴细胞比率显著高于B组及正常对照（P均

关键词：全血细胞减少：免疫相关性；自身抗体；流式细胞术：B淋巴细胞：CD5+B淋巴细胞

中图分类号：R446.11+3

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）05-0418-05

免疫相关性全血细胞减少症（immuno-relatedpancytopenia，irp）是由于T淋巴细胞调控失衡导致B淋巴细胞数量、亚群、功能异常，进而B淋巴细胞产生自身抗体，最终引起血细胞减少症候群。作为临床多个学科易见的疾病，其与再生障碍性贫血（aplastic anemla，AA）、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）、阵发性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria， PNH）、慢性病性贫血（anef11ia of chronic disease，ACD）等骨髓衰竭性疾病不易区分，容易混淆，危害性大，治疗难以着手，是困扰临床医师的一大难题。

自2001年IRP由邵综鸿等提出以来，对于IRP的实验室诊断研究尤为引起关注。目前IRP患者自身抗体的实验室检测手段有骨髓单个核细胞Coambs试验、骨髓细胞抗体放散试验、流式细胞术双标法，其中敏感性最高的属流式细胞术双标法。近期有研究提出，IRP患者自身抗体的产生可能与骨髓B淋巴细胞及其亚群数量异常有关。本文在证实流式细胞术双标法检测患者自身抗体敏感性的同时，摸索最佳检测条件以便日后开展于临床检验。并利用流式细胞术检测正常人、非免疫系统的恶性血液病患者及IRP患者外周血B淋巴细胞及CD5+B淋巴细胞比率，比较三类患者的差异，为IRP的鉴别诊断提供更多的鉴别参考，而且还有利于制定更有效的治疗策略。

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实验部分

1.1 材料

1.1.1 病例

29例患者均取自于云南省第一人民医院血液科初治住院病人，其中18例按照文献[4]标准拟诊为IRP患者，男11例、女7例，年龄17―56岁，即未明确诊断组（A组）；另11例为明确诊断非免疫相关陛恶性m液病组（B组），男5例、女6例，年龄17-48岁，分别诊断为再生障碍性贫血3例、阵发性睡眠性血红蛋白尿4例及骨髓曾生异常综合征4例，均符合国内诊断标准；A组经确诊为IRP后设为C组；另设正常对照22例，其中男11例、女11例，年龄18～56岁。

l.1.2 试剂与仪器

异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人IgG、IgM、IgA、CD5、CD3单克隆抗体，藻红蛋白（PE））标记的鼠抗人CD34、CD15、CD19、CD235、CD4单克隆抗体以及它们各自的同型对照均购自于美国Beckman Coulter公司，流式细胞仪型号FM500MPL为Beckman Coulter公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 Facs双标法检测骨髓造血细胞自身抗体

取9根检测管分成3组均加入肝素抗凝的骨髓液100μL，3组分别加入PE荧光标记的鼠抗人CD15或PE标记的鼠抗人CD34、PE标记的鼠抗人Glyco-A单克隆抗体20 μL，每组内再分别加入FITC标记的鼠抗人IgG、IgM、IgA。常温避光孵育20 min后，加入红细胞裂解液，混匀后室温孵育10 min，最后加入适量PBS液混匀。同型对照加入鼠抗人IgGl单克隆抗体-PE、鼠抗人IgG2单克隆抗体-FITC各20 μL，按同样方法操作。处理后标本上流式细胞仪测定骨髓单个核细胞（CDl5+细胞、CD34+细胞、GlycoA+细胞）表面自身抗体IgG 、lgM、IgA的结合率。每个样品收集15 000个细胞。

1.2.2 检测外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比率

取1根检测管，加入20 μL PE标记的鼠抗人CD19单克隆抗体、20μL EITC标记的鼠抗人CD5单克隆抗体，再加入100 μL新鲜外周血，混匀，室温避光孵育20 min，加入红细胞裂解液，混匀再孵育10 min，加入适量PBS液混匀。同型对照管加入FITC标记的鼠抗人LgG2单克隆抗体、PE标记的鼠抗人IgCl单克隆抗体各20μL，其他均按同样方法操作。处理好样品用流式细胞仪分别测定CD5+CD19+、CD19+细胞的表达率。每个样本收集15 000个细胞。

1.2.3 统计学处理

应用SPSS19.0数据软件进行相关数据分析，对正态分布的数据变量以x±s表示，用t检验比较两组间是否有显著性。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 骨髓单个核细胞表面相关抗体的表达

A组：参照天津医科大学血液肿瘤科标准，各型造血细胞（粒细胞、造血干/祖细胞、红细胞）与各种自身抗体（IgG .IgM、IgA）的结合率大于4%为阳性，和（或）CD5+CD19+/CD19+细胞比率明显偏高：18例拟诊断为免疫相关性全血细胞减少症患者中16例骨髓自身抗体检测结果阳性，阳性率为88.88% （此16例设为C组）。参照既往文献骨髓单个核细胞Coombs试验阳性率为46.43%

B组：11例巾1例骨髓自身抗体检测结果为阳性，阳性率为9.09%，此例阳性患者为再生障碍性贫血患者。比较两组，未明确诊断组阳性率显著高于明确诊断组（表1）。骨髓造血细胞自身抗体检测阳性典型图例见图1。

2.1.2 外周血总B淋巴、CD5+B淋巴细胞比率

C组患者总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比率为（13.00±6.81）%和（16.71±15.91）%，B组总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比率为（9.27±3.52）%和（5.23±2.21）%，正常对照组总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比率为（11.9±3.05）%和（8.13±3.96）%。C组CD5+B淋巴细胞、B淋巴细胞比率显著高于正常对照组及B组（P均

2.2 讨论

IRP是临床多个学科易见的疾病，患者主要临床表现为出血、贫血、感染及某些脏器受损，仅凭临床表现和其他血细胞减少症无法鉴别。邵宗鸿等曾提出此类疾病的拟诊标准：血象三系或两系、一系血细胞减少，但网织红细胞或（和）中性粒细胞百分比不低；骨髓红系或（和）粒系百分比小低，或巨核细胞不少，易见红系造血岛或嗜血现象；除外了其他原、继发血细胞减少症。符合以上条件者可拟诊IRP（三系血细胞少）或IRH（一系或两系血细胞少），符合拟诊标准者测及骨髓造血细胞膜结合自身抗体后确诊。

对于此类患者骨髓造血细胞膜结合自身抗体的检测方法，和虹等发现此类患者骨髓单个核细胞Coombs试验阳性。付蓉等提出利用流式细胞术双标法检测此类患者骨髓造血细胞膜结合的自身抗体，其试验敏感性较骨髓Coombs试验更高。近年来有学者发现了一种基层医院易开展的骨髓细胞抗体放散试验，其敏感性也比Coombs试验高。分析既往检测方法发现，传统的实验方法是用外周血或/和骨髓做Coomb's试验来诊断溶血的原因。然而如果抗体是针对骨髓早期造血细胞（造血干/祖细胞、有核红细胞、有核粒细胞），传统方法将无法榆测到抗体存在。因而利用流式细胞术可标记早期造血细胞，并对其表面抗体表达进行检测的特点，可以解决这一技术难点。B淋巴细胞是骨髓造血细胞自身抗体的产生机制，现已有研究证实IRP患者自身抗体的产生与B淋巴细胞及其亚群数量异常、功能亢进及调亡受抑有关。Seidi等住多发性硬化症中观察到CD5+B细胞与髓鞘蛋白抗体产生有关，并且也与多发性硬化的活动期有关；Huck等研究系统性红斑狼疮（SLE）得出同样结论，发现活动期SLE患者的CD5+B细胞是升高的，而非活动期SLE患者CD5+B细胞是下降的，提示CD5+B细胞的改变与SLE病情活动有关。2005年研究者发现：此类患者B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比率明显高于正常对照组，并进一步发现此类患者B淋巴细胞并非单克隆的恶性细胞。

本文检测IRP患者和其他恶性mL液病患者外周血B淋巴细胞及其CD5+B淋巴细胞结果显示，IRP患者外周血CD5+B淋巴细胞比率显著高于恶性血液病患者及正常对照组。结合临床分析发现，确诊IRP患者中B淋巴细胞数量、亚群比率及功能异常，进而使B淋巴细胞生存时间延长，促进抗体分泌，导致患者全血细胞减少。这与既往研究结果相一致，即Thl型细胞因子介导B淋巴细胞凋亡，IRP患者Thl型细胞因子较正常人，特别是AA明显降低。正常对照组外周血 CD5+B淋巴细胞显著高于恶性血液病患者，B组中MDS、AA、PNH这类疾病均是骨髓造血功能出现障碍或异常的骨髓造血功能衰竭性疾病，尤其是AA是一类T淋巴细胞功能亢进，通过细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）直接杀伤或凋亡骨髓导致的造血功能衰竭症，这些不稳定因素可能导致B组CD5+B淋巴细胞比率偏低。提示此类疾病可能因骨髓造血功能衰竭而致CD5+B淋巴细胞比率偏低。

3 结论

对比传统的骨髓单个核细胞Coombs试验，利用流式细胞术检测骨髓单个核细胞自身抗体灵敏性显著增高。IRP患者B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞显著高于非免疫性恶性血液病患者，此亦可以作为诊断MDS、AA、PNH等疾病时的鉴别参考之一。本实验检测还发现非免疫性的恶性血液病患者B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比率显著低于正常对照组，文章中作了部分分析，深层次的原因还有待于进一步的研究。