脓毒症内皮细胞损伤与炎症、凝血相关性研究
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【摘要】目的 观察脓毒症患者内皮细胞功能、炎症因子以及凝血指标的表达，探讨三者的关系。
方法 采用前瞻性对照研究方法。选择宁夏医科大学总医院重症监护病房（ICU）收治的70例危重病患者，依据脓毒症及全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome， SIRS）诊断标准分为脓毒症组38例、SIRS组32例。另选取健康体检者20例作为健康对照组。Sepsis组和SIRS组患者在高血压、糖尿病及其并发症构成有可比性。各组性别、年龄构成、吸烟、饮酒状况、体质量指数（BMI）方面相匹配有可比性。患者于入住ICU 24 h内抽取晨起空腹肘静脉血6 ml，分离血浆。采用双抗体夹心ABC酶联免疫吸附（ELISA）法测定标本中sCD62P水平、TNFα水平。同时测定超敏C反应蛋白（hsCRP）水平和血小板计数（PLT）、血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、D二聚体（Ddimer）水平、抗凝血酶Ⅲ活性（ATⅢ）；收集纳入研究患者的临床资料，进行SOFA评分；所有数据采用SPSS 17.0版统计软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析，对于非配对方差不齐资料，采用非参数法秩和检验（Keuskal Wallis），比较分析各组sCD62P水平、炎症因子和凝血指标的差异，并采用Pearson相关分析法分析sCD62P水平与上述炎症因子和凝血指标的相关性。以P
结果 ① 与健康对照组和SIRS组比较：脓毒症组sCD62P水平、hsCRP和TNFα水平均明显升高 （P
结论 脓毒症患者血浆sCD62P的表达明显增高，是内皮细胞损伤的早期生物标志物；炎症与凝血功能障碍相互作用促进了脓毒症的发生和发展；可溶性颗粒膜蛋白CD62P是脓毒症炎症凝血网络形成的重要始动因素。
【关键词】脓毒症；内皮细胞损伤；可溶性颗粒膜蛋白CD62P；炎症因子；凝血功能
Endothelial cell injury correlates with inflammatory cytokine and coagulation in the patients with sepsis DING Huan，CAO Xiangyuan，MA Xigang，ZHOU Wenjie. Intensive Care Unit，The General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China
Corresponding author：DING Huan，Email：
【Abstract】Objective To observe the clinical findings about the endothelial cell injury related to the genesis of inflammatory cytokines and coagulation. Methods A total of 70 critically ill patients with SIRS （systemic inflammatory response syndrome） admitted to intensive care unit（ICU）between September 2009 and February 2010 were enrolled for a prospective and control study. According to diagnostic criteria of Sepsis/SIRS，the patients were divided into two groups：sepsis group （n=38） and SIRS group （n=32），and another 20 healthy volunteers served as control group. Patients in the sepsis group and SIRS group were matched by clinical signs of high blood pressure，diabetes and its complications.The demographics of patients including age，sex，body mass index （BMI），smoking and alcohol addict were comparable among the different groups.The 6 ml peripheral blood samples were collected within 24 h after admission to ICU for enzymelinked immunosorbent assay （ELISA） to detect the plasma levels of sCD62P， TNFα， and hsCRP. And variables of coagulation function such as platelet （PLT），prothrombin time （PT），activated partial thromboplastin time （APTT），Ddimer and antithrombinⅢ （ATⅢ） were analyzed during 24 h after admission to ICU. Meanwhile sequential organ failure assessment （SOFA） score of critically ill patients was evaluated. Data were expressed in mean±standard deviation and were statistically analyzed by using SPSS 17.0 statistical software.The differences in plasma levels of sCD62P of patients in each group were analyzed by ANOVA and Kruskal Wallis test.The relationship between sCD62P and inflammatory cytokines as well as with coagulation were determined by Pearson correlation analysis.Changes were considered as statistically significant if P value was less than 0.05. Results ① Compared with control group and SIRS group， the levels of sCD62P，TNFα and high sensitive Creactive protein （hsCRP） were significantly higher in sepsis group （P
【Key words】Sepsis；Endothelial cell injury；Plasma soluble CD62P；Inflammatory factor； Coagulation
目前认为，脓毒症是全身炎症平衡紊乱所致的进行性的内皮细胞损伤，白细胞和血小板激活，损坏凝血系统，最后引起多器官功能障碍[1]。颗粒膜蛋白CD62P作为黏附分子选择素家族的重要成员，是内皮损伤和血小板活化的标志物[2]，也是启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分。目前对颗粒膜蛋白CD62P的研究多集中在心血管疾病方面，关于颗粒膜蛋白CD62P在脓毒症发生发展中对内皮细胞损伤与炎症和凝血之间关系的研究比较少。本研究对于脓毒症患者血浆可溶性颗粒膜蛋白CD62P（sCD62P）的表达及其作用机制给予高度关注，欲以此探讨脓毒症患者内皮细胞损伤与炎症反应和凝血之间的关系，为有效干预治疗脓毒症提供以CD62P为靶标抗黏附治疗等科学依据，以助于提高危重症救治成功率。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本研究选择2009年9月至2010年2月在宁夏医科大学总医院重症监护病房（ICU）住院治疗的70例SIRS患者，其中男性54例，女性16例，年龄（49.1±19.1）岁。70例SIRS患者中诊断为Sepsis的有38例，其原发疾病构成如下：创伤19例、肺部感染5例、腹部外科危重症12例；32例SIRS患者原发疾病构成为：创伤17例、腹部外科危重症10例、择期手术者5例。另选取健康体检者20例作为健康对照组。
本研究对于既往存在高血压、糖尿病及其并发症而分别纳入Sepsis组和SIRS组的患者进行构成比较差异无统计学意义 （P>0.05）。同时比较三组研究对象性别、年龄构成差异无统计学意义（P>0.05）；吸烟、饮酒状况方面以及在临床资料如体质量指数（BMI）等方面差异无统计学意义（P>0.05），有可比性 。见表1。
剔除既往存在肝脏（肝硬化和门脉高压）、肾脏（长期接受透析）慢性器官功能不全者，以及存在免疫抑制状态（接受免疫抑制治疗、放化疗、白血病、淋巴瘤及艾滋病等）的患者。对于使用抗凝药物、恶性肿瘤、妊娠分娩前后患者及年龄小于14岁的儿童均不纳入研究。
本研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会批准，并且研究对象入选前获知情同意。
1.2 检测指标及方法
收集纳入研究患者的临床资料，进行SOFA评分；于入住ICU 24 h内抽取晨起空腹肘静脉血6 ml，同时分别注入1号和2号0.109 mmol/L枸橼酸钠1∶9负压抗凝管内各3 ml，混匀后以3000 r/min离心10 min。1号管分离出血浆置-80℃保存成批待检。采用双抗体夹心ABC酶联免疫吸附（ELISA）法测定标本中sCD62P水平、TNFα水平。严格按照试剂盒（美国R&D公司产品）说明书进行操作。2号管分离出血浆，室温放置不超过2 h，2～8℃保存不超过4 h，立即送检进行凝血指标检测。
1.3 统计学方法
计量资料以均数±标准差（x±s）表示，非正态分布资料用中位数（M）表示；两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，对于非配对方差不齐资料，采用非参数法秩和检验（Keuskal Wallis），正态分布资料相关分析采用Pearson相关。以P
2 结果
2.1 各组血浆sCD62P水平比较
脓毒症组sCD62P水平明显升高（P0.05），但是通过均值图可以显示随着炎症反应严重程度的加重，sCD62P水平有上升趋势。见表2。
2.2 各组血浆hsCRP、TNFα水平和SOFA评分比较
脓毒症组hsCRP和TNFα水平均明显升高 （P
2.3 各组PLT计数、PT、APTT、 Ddimer水平和ATⅢ活性比较
脓毒症组和SIRS组Ddimer水平显著升高，PT、APTT 显著延长（P
2.4 患者炎症与凝血/指标的相关性分析
危重病患者hsCRP和TNFα分别与Ddimer、PT、APTT呈正相关；而与PLT计数、ATⅢ活性呈负相关。见表4。
2.5 患者血浆sCD62P水平与炎症因子及凝血指标的相关分析
危重病患者血浆sCD62P水平与hsCRP和TNFα明显正相关，差异具有统计学意义（P
3 讨论
越来越多的证据表明白细胞与内皮细胞或血小板相互作用导致的内皮细胞损伤、血小板活化在脓毒症发生发展过程中起到重要作用。颗粒膜蛋白CD62P主要存在于内皮细胞WeibelPalade小体及静息血小板α颗粒中，在组织缺氧、炎症介质刺激下活化的内皮细胞或血小板首先表达颗粒膜蛋白CD62P，通过与细胞表面P选择素糖蛋白配体1（PSGL1）结合，介导内皮细胞或血小板与白细胞起始黏附的启动，并参与白细胞在内皮上黏附迁移级联过程[3-4]。黏附后的中性粒细胞分泌髓过氧化物酶、组织蛋白酶G、弹力蛋白酶等，并产生活性氧家族，以引起内皮细胞损伤[5-6]，通过实验室检测其含量或代谢产物的含量可以间接评价内皮功能[7]。
本研究证实脓毒症组血浆sCD62P水平明显高于SIRS组和健康对照组。虽然SIRS组sCD62P水平与健康对照组比较差异无统计学意义，但是通过均值图可以显示随着SIRS的进展，sCD62P水平逐渐增高，表明CD62P参与炎症反应并介导了脓毒症发生与发展，是内皮细胞损伤的早期生物标志物。国内有研究表明危重患者凝血/纤溶功能出现紊乱，同时存在以黏附分子α颗粒膜蛋白140即CD62P显著升高为特点的内皮细胞损伤[8]。临床中可以联合检测循环内皮细胞（cECs）、内皮细胞特异性分子1（ESM1）、黏附分子颗粒膜蛋白CD62P及E选择素、可溶性血栓调节蛋白（sTM）、血管生成素2（Ang2）等多种内皮细胞损伤生物标记物检测内皮损伤[9]。但是上述生物活性物质的测定难以区分是血管内皮受刺激引起还是血管内皮功能受损引起，故内皮活性物质测定在临床上的应用存在一定局限。
本研究结果显示，脓毒症组和SIRS组患者Ddimer水平明显增高，PT、APTT时间明显延长，而ATⅢ活性明显低于健康对照组。Levi等[10]研究也证实了在严重的炎症反应过程中，AT水平明显下降 。说明随着脓毒症的发生发展，炎症引发机体凝血系统活化同时出现生理抗凝机制下调以及纤溶系统抑制[11] 。本组资料还显示危重患者Ddimer、ATⅢ、PT及APTT均与TNFα和hsCRP显著相关。张伟等[12]研究也报道了感染患者凝血功能障碍程度与脓毒症严重程度密切相关。进一步证实凝血系统与炎症反应之间存在着密切的网络联系，炎症与凝血/纤溶相互作用、相互促进，共同促进脓毒症的发生发展[13]。
本研究结果显示，CD62P水平不仅参与炎症反应，与hsCRP和TNFα有关；而且参与血小板活化、参与微血管内广泛微血栓形成，与Ddimer、ATⅢ活性、PT和APTT密切相关，是脓毒症发生炎症反应与凝血/纤溶功能障碍的重要始动因素。Mosad等[14]研究了176例脓毒症DIC患者，发现CD62P水平与DIC评分、纤维蛋白原消耗、Ddimer、凝血酶激活标记呈正相关。 颗粒膜蛋白CD62P不仅能够启动炎症的级联反应，也能触发凝血级联反应。CD62P介导血小板黏附在内皮细胞和白细胞，激活核因子κB（NFκB）增强单核细胞表达释放组织因子（TF），然后与活化的血小板膜融合，启动凝血过程[15]；并通过激活外源性凝血途径，产生纤维蛋白，引发血栓前高凝状态[16]。活化的白细胞同时又能释放组织蛋白酶和弹性蛋白酶，水解组织因子途径抑制物（TFPI），进一步激活血小板和凝血因子V，还能释放活性氧，直接或间接地激活或损伤血管内皮，从而加速血栓形成过程[16]。目前研究者日益关注CD62P在脓毒症炎症/凝血以及器官功能障碍中的作用。动物实验发现，由于内皮细胞损伤、颗粒膜蛋白CD62P等黏附分子表达增加导致广泛微血管炎症和血栓形成，并且明显增加了脓毒症病死率[2]。
总之，内皮细胞损伤、炎症和凝血紊乱参与了脓毒症的全过程，并由多种因素触发形成网络效应。颗粒膜蛋白CD62P及其配体在脓毒症及脏器功能障碍的发生、发展中扮演着重要角色。在动物实验中已证明抗颗粒膜蛋白CD62P或阻断PSGL1治疗能改善脏器功能及预后，辛伐他汀等也可通过间接减少P表达来减少白细胞聚集，降低内毒素血症诱导的肝损害[17]。在脓毒症中的深入研究，将为进一步实验研究脓毒症与颗粒膜蛋白CD62P的关系及临床治疗提供很好的思路和手段，针对CD62P的抗黏附治疗可为脓毒症及其脏器功能障碍的防治提供一条新的途径。
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