乌珠穆沁羊生长过程中肌内结缔组织中Ⅲ型胶原蛋白的变化
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摘 要：采用1至18月龄不同生长阶段乌珠穆沁羊为研究对象，对其骨骼肌内结缔组织中提取Ⅲ型胶原蛋白，并进行SDS-PAGE电泳鉴定，利用高效液相色谱测定所提取的Ⅲ型胶原蛋白中三种主要氨基酸含量，并依据羟脯氨酸含量计算出Ⅲ型胶原蛋白的含量，通过SAS软件分析肌内结缔组织中Ⅲ型胶原蛋白随月龄增加的变化规律。结果表明，随着乌珠穆沁羊月龄的增加，骨骼肌肌内结缔组织Ⅲ型胶原蛋白中甘氨酸和脯氨酸含量显著下降
（P
关键词：乌珠穆沁羊；骨骼肌；肌内结缔组织；Ⅲ型胶原蛋白
Changes of Type Ⅲ Collagen in Intramuscular Connective Tissue during Growth of Ujumqin Sheep
WU Qiong， Lü Ya-qiong， ZHANG Dong-mei， BORJIGIN Gerelt*
（College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Huhhot 010018， China）
Abstract： Ujumqin sheep， aged from 1 to 18 months， were employed in this study. The type Ⅲ collagen of intramuscular connective tissue was extracted and identified by SDS-PAGE， also three major amino acids were determined by high performance liquid chromatography （HPLC）， and then the content of type Ⅲ collagen was calculated based on hydroxyproline. The changes of type Ⅲ collagen in intramuscular connective tissue during growth of Ujumqin sheep were analyzed by SAS software. The results showed that the glycine and proline contents in type Ⅲ collagen in intramuscular connective tissues were decreased significantly with increasing age of Ujumqin sheep （P < 0.05）， whereas the hydroxyproline content was increased significantly （P < 0.05）. In addition， the content of type Ⅲ collagen in intramuscular connective tissues showed a significant increase with the age of Ujumqin sheep （P < 0.05）.
Key words： Ujumqin sheep； skeletal muscle； intramuscular connective tissues； Type Ⅲ collagen
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）05-0001-05
肌内结缔组织的主要成分、胶原蛋白占动物体全蛋白质的1/4～1/3。因动物的种类、性别、肌肉类型和不同生长阶段中胶原蛋白含量各不相同。肌外膜、肌束膜以及肌内膜有它们独特的形态结构，而这些结构其应对它各自的机能而形成。这些形态结构特征因构成胶原蛋白细纤维的三维结构排列的不同而有所差异。胶原蛋白是由3条多肽链以特有的右旋，形成螺旋状的胶原蛋白分子，构成的多肽链叫α链。胶原蛋白有许多种遗传性变异体。Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ型胶原蛋白广泛分布于骨骼肌肌束膜和肌内膜之中，Ⅳ型在肌内膜、特别是基底膜的稠密层里存在。Ⅰ型主要存在肌束膜，Ⅲ型以及Ⅴ型在肌束膜和肌内膜中的存在。因结构的不同，有可能食肉质地之间有某种程度的相关关系。Nishimura等[1]报道牛生长过程中的不同类型胶原蛋白的变化和存在位点。Listrat等[2]在猪、兔、生长110d和成年牛骨骼肌中前后发现了Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型5种胶原蛋白。据报道[3]，Ⅲ型胶原蛋白是纤维型胶原蛋白的胚胎形式，随着动物的成熟Ⅲ型胶原蛋白逐渐被Ⅰ型胶原蛋白和具有更成熟交联结构的胶原蛋白所代替。所以Ⅰ型和Ⅲ型胶原在不同年龄动物肌肉中含量不同且还可能相互转换。家畜的不同饲养管理、不同生长速度和饲草料以及血统的不同也影响胶原蛋白特性[3]。随着动物的生长胶原蛋白交联形成的程度增加。这主要受家畜品种、年龄、肌肉部位以及饲养等因素的影响。胶原蛋白总含量、胶原蛋白类型、分子之间的交联形成、热稳定性等影响食肉品质的一个重要因素。Ngapo等[4]发现比利时牛杂交双层肌肉牛和纯种双层肌肉牛的半腱肌和股二头肌中的胶原蛋白含量和胶原蛋白交联浓度也有所差异。Shiba等[5]对山羊肌肉中的速肌之腓肠肌和慢肌的比目鱼肌中胶原蛋白和胶原吡啶交联浓度的变化进行比较研究时发现，出生之前两种骨骼肌中的总胶原蛋白的百分比可溶性胶原蛋白浓度显著下降，之后下降比率慢慢缓解。青春前期之间两种骨骼肌中总胶原蛋白的胶原吡啶交联浓度增加，但比目鱼肌中胶原吡啶交联浓度与腓肠肌相比增加的快而浓度高。胶原吡啶交联浓度的增加是出生前期之间开始，而且随着年龄的增加交联程度的发达比目鱼肌中的比腓肠肌的快。
本研究采用我国优良地方品种乌珠穆沁羊，研究生长过程中骨骼肌Ⅲ型胶原蛋白变化。以往对羊肉的相关研究主要集中在宰后肉的成熟、饲草料与肉风味之间的关系方面研究较多。而对家畜生长过程中不同类型胶原蛋白在肌内结缔组织中含量方面的研究极少。已有文献对乌珠穆沁羊生长过程中肌内结缔组织胶原蛋白含量和热溶解、蛋白多糖、胶原蛋白细纤维变化、吡啶诺林含量、糖醛酸含量、肌纤维类型变化以及Ⅰ型胶原蛋白等方面进行了探讨过[6-9]。因此，在此研究基础上进一步探讨乌珠穆沁羊的骨骼肌中Ⅲ型胶原蛋白的含量进行探讨。以及不同月龄肉羊的骨骼肌进行对比研究。这对掌握乌珠穆沁羊的肌内结缔组织的变化规律和乌珠穆沁绵羊的产肉性能的改变和肉质量的提高、食肉嫩化成熟机理研究等提供重要的科学理论依据。对于畜牧业生产和畜产食品加工具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选择自然放牧条件下的1、3、6、9、12 月和18 月龄的乌珠穆沁羊，所选的各月龄肉羊是同一个羊群中年龄相同的去势公羊，每个月龄选用3 只。屠宰后采取股二头肌，将样品直接投入液氮中速冻，放置在-80 ℃条件下保存。
三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS） 南京博尔迪生物科技有限公司；盐酸胍 上海生工生物；β-巯基乙醇、胃蛋白酶（Pepsin）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、溴酚蓝、羟脯氨酸对
照品 美国Sigma公司；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、苯基甲烷磺酰氟化钠（PMSF）、考马斯亮蓝R-250 加拿
大BIObasic Inc生物工程公司；对甲氧基苯磺酰氯（MOBS-Cl）、脯氨酸对照品（L-proline） 成都格雷西亚化学技术有限公司；甘氨酸对照品 上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯） 天津市光复精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
Arium 61316超纯水器 德国赛多利斯仪器厂；XHF-D型高速分散器 宁波新芝生物公司；H2500R-2型冷冻高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；BG-power 600型稳流恒压电泳仪 北京百晶生物技术有限公司；LGJ-10C型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；pB-10型pH计 北京赛多利斯科学仪器有限公司；DSH-300A型回旋式恒温水浴振荡器 上海
雅荣生化设备有限公司；GRX-9253A型热空气消
毒箱 上海一恒科技有限公司；SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；KQ-800TDE型高频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Agilent Technologies 1260 Infinity HPLC 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 Ⅲ型胶原蛋白的提取
参考久保木方德[10]、永井裕[11]和Fujii等[12]的方法进行提取。取肌肉组织20 g，实验时4 ℃下解冻，除去外侧脂肪和肌外膜；破碎，将肉样置于烧杯中加入10倍量（V/V）的洗净液（1 mL β-巯基乙醇，1 mL PMFS，5 mL EDTA，3.582 g Na2HPO4，用蒸馏水定容至1 L）充分搅拌之后破碎均质；离心（5000 r/min，15 min），去除上清液，沉淀上加肉样的10倍量（V/V）洗净液，缓慢搅拌3～10h后离心；重复5～7次，直到上清液透明为止。去除上清液，沉淀上加肉样10倍量（V/V）抽出液（1 mg/mL
胃蛋白酶-0.5 mol/L醋酸），缓慢搅拌室温下过夜；离心（10 000 r/min，20 min），将上清移入烧杯中，缓慢搅拌并加入粉末状NaCl，使终浓度达到2 mol/L，
室温过夜；离心（10 000 r/min，20 min），去除上清液，沉淀用10倍量50 mmol/L醋酸溶液溶解；离心，上清液加入粉末状NaCl，使终浓度达到1 mol/L，缓慢搅拌过夜；离心后用沉淀的10倍量50 mmol/L醋酸溶液溶解，分别用 0.45 mol/L NaCl-5 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液和1.2 mol/L NaCl-5 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液透析12 h；高速离心，取沉淀，4 ℃用蒸馏水透析12 h，离心（100000×g，1 h），取沉淀（Ⅲ型胶原蛋白）备用。
1.3.2 利用聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）对Ⅲ型胶原蛋白纯度的鉴定
参考Leammli[13]的方法对冻干的各月龄Ⅰ型胶原蛋白样品进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳[10]。分别配制8%的分离胶和5%的浓缩胶溶液。凝胶后，用微量取样器吸取已处理好的蛋白质样品12 μL，分别单个注入胶孔。保持恒压100 V，进行电泳。电泳结束后，加入染色液过夜，次日倾出染色液，用蒸馏水漂洗2次，然后加入脱色液，室温浸泡凝胶，直至蛋白质区带清晰为止，采集图像。
1.3.3 利用高效液相色谱测定Ⅲ型胶原蛋白中3种主要氨基酸含量
参考周桂友等[14]、崔琳等[15]的方法测定Ⅰ型胶原蛋白中羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量。将冻干的Ⅲ型胶原蛋白溶于6 mol/L HCl溶液中，110 ℃水解12 h，冷却，用6 mol/L NaOH溶液中和后取胶原蛋白水解液1 mL，加入5 mL乙腈，超声振荡20 min，然后在离心机中以5 000 r/min
离心10 min。取离心后上清液200 μL加入200 mmol/L
Na2HPO4溶液1 mL和500 μmol/L MOBS-Cl溶液200 μL使其充分混合，混合物在45 ℃恒温振荡反应35 min。冷却后，上层溶液经0.22 μm滤膜过滤后进入高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。
色谱条件：SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m）；流动相组成：A相为磷酸缓冲液（15 mmol/L，
pH3.5），B相为乙腈（使用前过0.22 μm滤膜），梯度洗脱：0～8 min，17%～34% B，8～10 min，34%～40% B，10～15 min，40% B，15～20 min，40%～17% B；流动相流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测器检测波长232 nm。
1.3.4 各月龄乌珠穆沁羊肌内结缔组织中Ⅲ型胶原蛋白含量测定
参考Grant[16]的方法计算Ⅲ型胶原蛋白百分含量：胶原%=HYP%×7.46（7.46为换算常数）。
2 结果与分析
2.1 SDS-PAGE凝胶电泳分析Ⅲ型胶原蛋白
1. 1月龄；2. 3月龄；3. 6月龄；4. 9月龄；5. 12月龄；6. 18月龄。
图 1 骨骼肌Ⅲ型胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图
Fig.1 SDS-PAGE profile of type Ⅲ collagen of skeletal muscles
由图1可知，Ⅲ型胶原在SDS-PAGE凝胶上得到清晰的分离，条带中显示出一条α（Ⅲ）肽链与一条β（Ⅲ）肽链，其中β（Ⅲ）肽链是α（Ⅲ）的二聚体，基本符合Ⅲ型胶原蛋白的结构特征，可以初步判定所提取的胶原蛋白为Ⅲ型胶原蛋白。图中各月龄条带深浅基本一致，可以说明Ⅲ型胶原蛋白各月龄之间变化不大。
2.2 胶原蛋白中三种主要氨基酸含量测定结果
2.2.1 线性关系考察
取羟脯氨酸13.1 mg、脯氨酸11.5 mg、甘氨酸7.5 mg，置100 mL容量瓶中，用200 mmol/L pH 9.3的Na2HPO4衍生缓冲液配制成1 mmol/L标准液，分别稀释成浓度为2、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L的标准溶液。定量移取每种氨基酸1 mL于10 mL具塞试管内，加入MOBS-Cl的乙腈溶液（500 μmol/L）2 mL，混匀，盖紧瓶塞后将其放入45 ℃水浴锅中恒温振荡35 min。进样前用0.22 μm滤膜过滤。按上述色谱条件，移取标准系列反应液各20 μL进样，以峰面积值（A）为纵坐标，氨基酸浓度（c）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程（表1）。
2.2.2 胶原蛋白中3种主要氨基酸含量测定
1.脯氨酸（proline）2.甘氨酸（glycine）3.羟脯氨酸（hydroxyproline）
图 2 对照品（A）和样品（B）的HPLC色谱图
Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances （A） and sample （B）
按照建立的HPLC方法分别对实验中提取的各月龄（1、3、6、9、12、18月龄）的Ⅲ型胶原蛋白中3种主要氨基酸，即羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量进行测定。如图2所示（以1月龄为例），通过峰面积积分值代入回归方程，求得各氨基酸平均含量，结果如表2所示。
从表2可看出，随月龄的增大，乌珠穆沁羊骨骼肌肌内结缔组织中羟脯氨酸不断增加，甘氨酸和脯氨酸含量有不断减少的趋势。通过SAS软件的ANOVA方差分析对所测结果进行分析可知，Ⅲ型胶原蛋白中甘氨酸和脯氨酸在1月龄和3月龄之间差异不显著（P>0.05），其他各月龄之间2种氨基酸含量差异显著（P
2.2.3 乌珠穆沁羊生长过程中Ⅲ型胶原蛋白含量的变化分析
同理计算Ⅲ型胶原蛋白含量。表2中的数据表示各月龄每单位湿质量乌珠穆沁羊股二头肌中Ⅲ型胶原蛋白含量的平均值和标准差。根据表2中的数据可知，随月龄的增加，肌内结缔组织中Ⅲ型胶原蛋白的含量不断增加。通过SAS软件的ANOVA方差分析对所测结果进行分析可知，Ⅲ型胶原蛋白含量各月龄之间差异均显著
（P
3 讨 论
Ⅲ型胶原蛋白是构成肌内结缔组织中肌内膜和肌束膜的主要成分之一，它的含量与性质对食肉嫩度和食肉加工特性有一定影响。Seideman等[17]报道，不同品系的牛和羊，由于它们的性成熟时间不同还会使品系和性别、年龄一起协同影响肌肉内胶原蛋白的含量。此外，来自相同品系的牛和羊，同一肌肉的不同部位中胶原蛋白含量也存在差异。Lovell等[18]研究证明，哺乳动物Ⅲ型胶原蛋白的含量在其生长初期处于较高水平，但随着动物生长期的不断延长，由于胶原蛋白酶的作用使得Ⅲ型胶原蛋白部分被降解，从而导致Ⅲ型胶原蛋白的含量逐渐降低，而Ⅰ型胶原蛋白的含量逐渐升高。Ⅲ型胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白分子的不同之处在于，Ⅲ型胶原蛋白分子之间含有二硫键，这个共价键在肉制品的加热熟制过程中，由于热收缩而引起成熟胶原蛋白稳定性的增加，从而使肉的硬度增加。Mccormick[19]认为，随着动物年龄的增长，胶原蛋白之间非还原联的结构增多，这就使得胶原蛋白更加稳定，难以消化和水解，从而导致肌肉嫩度下降。李晓波[20]对不同月龄苏尼特羊的不同部位的肌肉总胶原蛋白含量进行分析后表明，随着月龄的增加，总胶原蛋白的含量呈增加的趋势，同一月龄不同部位肌肉中总胶原蛋白含量也不同。本课题组已有研究也证明了乌珠穆沁羊随着月龄的增加肌内结缔组织以及Ⅰ型胶原蛋白含量不断增加[6-8]。肌肉中胶原蛋白含量的增加与肌肉组织本身的生长发育有同步的原因是因为随着动物年龄的增加，胶原纤维的平均直径及分子间的交联程度不断增加，肌肉中的胶原蛋白以量的增长为主，当达到一定年龄后，肌肉中的胶原蛋白则主要与分子间的交联结构变化有关。本实验分析了乌珠穆沁羊随月龄的增加肌内结缔组织中Ⅲ型胶原蛋白含量的变化规律，但对家畜肌内结缔组织中胶原蛋白共价交联以及它的交联程度对肉质的作用还存在争议，有待进一步研究。
4 结 论
不同月龄乌珠穆沁羊肌内结缔组织Ⅲ型胶原蛋白在SDS-PAGE凝胶上得到清晰的分离，条带中显示出一条α（Ⅲ）肽链与一条β（Ⅲ）肽链，其中β（Ⅲ）肽链是α（Ⅲ）的二聚体；乌珠穆沁羊生长过程中，随月龄的增大肌内结缔组织中甘氨酸和脯氨酸含量显著下降（P
（P>0.05），其他各月龄之间2种氨基酸含量均差异显著（P
（P
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