TLR2和TLR4在胎膜早破孕妇胎膜中的表达及意义
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【中图分类号】R714【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2010)06 - 10 - 04
【摘要】目的 通过检测胎膜早破孕妇胎膜组织中tlr2和tlr4的表达,探讨其与胎膜早破及绒毛膜羊膜炎的关系。方法 随机选择胎膜早破孕妇60例,包括足月前胎膜早破组(PPROM)30例、足月胎膜早破组(PROM)30例。选择正常非胎膜早破孕妇30例作为对照组。免疫组化方法测定三组孕妇胎膜组织中TLR2、TLR4的表达。结果 (1)胎膜早破孕妇胎膜组织中TLR2和TLR4的表达明显高于正常对照组;(2)有组织学绒毛膜羊膜炎者,其胎膜组织中TLR2和TLR4的表达高于无绒毛膜羊膜炎者。结论 TLR2和TLR4在感染引起的胎膜早破中起一定的作用。
【关键词】胎膜早破;绒毛膜羊膜炎;TLR2;TLR4;免疫组化
The expression of TLR2、TLR4 in fetal membranes in pregnant woman with premature rupture of membranes and clinical implication
【Abstract】Objective Through detect the expression of TLR2、TLR4 in fetal membranes in pregnant woman with premature rupture of membranes,to approach the relationship between them and chorioamnionitis。 Methods Women with premature rupture of membranes and normal women were studied,expression of TLR2、TLR4 in fetal membranes were detected by immunohistochemistry. Results (1)The levels of TLR2、TLR4 in fetal membranes in pregnant woman with premature rupture were significantly higher than that in the control group. (2)The levels of TLR2、TLR4 in the women with histological chorioamnionitis were significantly higher than that women without histological chorioamnionitis. Conclusion TLR2、TLR4 play a role in pregnant woman with premature rupture of membranes induced by infection.
【Key words】Premature rupture of membranes;chorioamnionitis;Toll-like receptor-2; Toll-like receptor-4;Immunohistochemistry
胎膜早破(premature rupture of membranes,PROM)是威胁母儿健康的产科常见并发症,发病率正逐年升高,是当前产科临床处理较棘手的问题之一。胎膜早破发生后,感染、早产、脐带脱垂、胎盘早剥、羊水栓塞、羊水减少、胎儿窘迫等并发症的发生率明显增加,大大增加了围生期母儿的发病率和死亡率。其发病率据报道约10%[1],近年来有上升趋势。目前大多数学者认为感染是胎膜早破的首要因素[2],而且感染与胎膜早破的发生发展互为因果。胎膜早破发生的主要原因是细菌、病毒等所致的绒毛膜羊膜炎,导致胎膜结构被破坏,其薄弱处发生破裂。
Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)在促进细胞因子的合成与释放、引发炎性反应中起着重要作用。TLRs广泛表达于各种免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和某些T淋巴细胞,也见于非免疫细胞如成纤维细胞和表皮细胞,是目前发现能识别病原微生物上的高度保守结构基序一病原相关分子模式的一组跨膜蛋白,通过识别内外源性致病原含有的保守病原体相关模式分子,启动宿主防卫反应,是免疫系统迅速抵抗微生物感染的一线武器。目前已知TLR2和TLR4分布广泛,可在人胎盘合体滋养细胞、中间型滋养层细胞、绒毛外滋养层细胞中表达[3]。对于羊膜上TLR2和TLR4的表达鲜有报道。本研究旨在探讨TLR2和TLR4在胎膜早破孕妇胎膜中的表达及临床意义。
1 资料与方法
1.1一般资料实验组:选取我院2008年1月至2009年6月住院分娩的胎膜早破患者60例,分为足月胎膜早破及足月前胎膜早破。其中足月胎膜早破组30例(平均年龄26.4±2.1岁,孕周37周-416周),经产后病理学检测分为绒毛膜羊膜炎组和非绒毛膜羊膜炎组。足月前胎膜早破组30例(平均年龄27.4±2.8岁,孕周305周-366周)。经产后病理学检测分为绒毛膜羊膜炎组和非绒毛膜羊膜炎组。对照组:选择同期住院因社会因素剖宫产分娩的非胎膜早破的孕妇30例作为对照组(平均年龄25.5±2.6岁,孕周37周-41周)。对照组胎膜病检均无绒毛膜羊膜炎。
所有病例均为初产妇,单胎,无内外科合并症及产科并发症,近期无外伤和等诱因,年龄及孕次差异无统计学意义(P>0.05)。分娩后直视下取胎膜破口处组织2块,大小约1cm×1cm,生理盐水清洗表面羊水和血迹,固定于10%福尔马林中,石蜡包埋,切片备用。
1.2 诊断标准
1.2.1 胎膜早破诊断标准[4]:主诉阴道流液,pH试纸碱性变色,对可疑病例消毒后放窥阴器检查见后穹窿有液体或手触见宫颈口有羊水流出。
1.2.2 组织学绒毛膜羊膜炎[5]:绒毛膜板及羊膜上白细胞呈弥散性聚集,每个高倍镜视野有5-10个中性粒细胞浸润,白细胞浸润呈极性分布。
1.3 实验方法及步骤采用免疫组化中敏感性高的亲和组织化学技术:酶标链亲和素-生物素技术(S-P法)。以PBS代替一抗作为阴性对照,以胎膜各层部分细胞胞浆和(或)胞核中出现棕黄色颗粒状物质视为阳性染色。
每个石腊标本4μm厚连续切片4张,其中1张作TLR2的免疫组化染色,1张做TLR4的免疫组化染色,1张作HE染色病理诊断,1张以PBS代替一抗作空白对照(阴性)对照,用已知TLR2 、TLR4组织切片肠上皮作为阳性对照。
1.4 主要试剂兔抗人TLR2、TLR4一抗:购自武汉博士德生物技术有限公司。免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司(为美国ZYMED公司SP试剂盒)。
1.5 结果判断观察阳性反应采用双盲法,参照Fromwitz综合计分法[6]行半定量分析。以光镜下细胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性。取表达最强的部分,根据阳性细胞百分率及显色深浅评分:(1)阳性细胞百分率:无阳性细胞为0;阳性细胞50%为3。(2)显色深浅:不显色或显色不清为0;浅黄色为l;棕黄色为2;深褐色为3。两项之和累积0～1分为阴性(-);2～3分为弱阳性(+);4～5分为中度阳性(++);6分为强阳性(+++)。
1.6 统计学分析实验结果均应用统计软件SPSS13.0处理,进行秩和检验,spearman等级相关分析。取显著性检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 各组胎膜TLR2、TLR4的表达TLR2阳性表达主要位于绒毛膜和羊膜细胞胞浆内,少数位于胞核内,呈棕黄色颗粒,(图1)。TLR4阳性表达主要位于绒毛膜和羊膜细胞胞核内,少数位于胞浆,呈棕黄色颗粒(图2)。
2.2 病理分级与TLR2、TLR4表达的关系采用秩和检验,各组间TLR2的表达变化,H=24.016,P=0.000
3 讨 论
PROM发生的原因是多方面的,但早破胎膜局部最基本的病理变化是炎症和胎膜本身结构缺陷。炎性反应因素在胎膜早破发生中的作用越来越受到重视[7]。而且感染与胎膜早破的发生发展互为因果。
近年来许多研究[8]发现,母胎界面特有的滋养细胞、羊膜细胞等,通过其遗传保守性蛋白-TLRs,可以识别病原,参与先天性免疫反应,进而对妊娠结局产生影响。Holmlund等[9]对正常足月妊娠胎盘免疫组化研究,证明其中有TLR2和TLR4的表达。Abrahams等[10]提出TLRs在介导母胎之间天然免疫中起重要作用。Chan等[11]提出TLR2与巨细胞病毒感染时胎盘滋养层细胞凋亡及胎盘TNF-α增高关系密切。这些研究均提示TLRs与感染相关。
本实验采用免疫组化的方法检测PROM组和正常对照组胎膜中TLR2、TLR4的表达情况,结果表明PROM组胎膜中TLR2、TLR4的表达明显高于正常对照组。且TLR2、TLR4的表达与绒毛膜羊膜炎有关,炎症的分级越高TLR2、TLR4的表达阳性率越高,且TLR2与TLR4的表达具有相关性,表明PROM与炎症相关。
许多研究表明PROM与感染有关[7],而TLR2、TLR4正是在炎性反应中发挥了重要作用。TLRs通过多种识别分子与其配体结合,在配体的作用下,经多种衔接分子将信号转导至胞内,激活核因子(NF)-KB、丝裂原激活的蛋白激酶p38和c-jun N端激酶等,介导免疫相关基因的表达,导致大量促炎因子如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)等释放,激活天然免疫系统,介导急性炎症反应,直接杀伤入侵的病原微生物;同时可通过诱导未成熟树突状细胞分化成熟,高表达主要组织相容性抗原复合物(MHC)和协同刺激分子,辅助抗原特异性获得性免疫应答的建立[12,13]。
据相关临床报道,有过足月自然分娩经历的足月分娩妇女与无该分娩史的足月分娩妇女比较[8],以及合并绒毛膜羊膜炎的孕妇与未合并该炎症的孕妇比较[14],发现其羊膜TLR2与TLR4表达均有所上调。在无绒毛膜羊膜炎合并症的病例中,发现TLR2的表达被限定于羊膜上皮细胞基底部,而这种极性特征在炎症存在的情况下则消失[14]。这与本实验的研究结果是一致的。
综上所述,PROM患者胎膜中TLR2、TLR4表达增加与IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ释放密切相关,其表达的增加可能是PROM发病机制中的一个环节。TLR2、TLR4可作为临床上检测绒毛膜羊膜炎的指标,对于判断母儿预后,决定分娩时机,临床用药决策有一定的指导意义。
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