丹参脂溶性成分抑制体外血管新生及机制研究
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[摘要] 该研究利用人脐静脉内皮细胞模型研究丹参脂溶性成分对血管新生的调节作用，并探讨其可能的作用机制。通过建立的细胞模型，确定丹参脂溶性成分对内皮细胞增殖活性和迁移能力的影响；随后利用实时荧光定量PCR技术检测药物作用后血管新生相关细胞因子VEGF-A，VEGF-C和MMP-9的基因表达变化。结果表明，5 mg・L-1的丹参脂溶性成分抑制内皮细胞的增殖和迁移，同时VEGF-A，VEGF-C和MMP-9基因的表达被抑制。表明丹参脂溶性成分可能通过抑制VEGF-A和MMP-9基因的表达来抑制内皮细胞的增殖和迁移，从而达到抑制血管新生的作用。
[关键词] 丹参脂溶性成分；血管新生；人脐静脉内皮细胞；实时荧光定量PCR；血管内皮生长因子
血管新生是一个高度复杂、严格调控的生理过程[1]。血管新生在心血管疾病、癌症、糖尿病和肥胖等疾病中发挥着重要作用，目前寻找合适的药物来促进或抑制血管新生已成为治疗这些疾病的主要研究方向。丹参为我国传统中药，主要由脂溶性和水溶性2种成分组成，具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等功效。目前对丹参脂溶性成分调节血管新生的研究大多都是从其单体成分入手，整体研究较少。丹参中的很多单体成分，如丹参酮ⅡA和隐丹参酮能够抑制内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成[2-5]，隐丹参酮和丹参酮ⅡA抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖和血管生成，但其机制并不十分清楚。同时考虑到对于心血管疾病、肿瘤等多因素导致的复杂疾病，中药多组分治疗具有独特优势，因此，本研究从整体出发，研究丹参脂溶性提取物对HUVECs的作用，并考察其对血管新生相关生长因子基因表达的影响，初步探讨其对血管新生的作用机制。
1 材料
1.1 仪器与试剂 RPMI 1640（Gibco，美国）；胎牛血清（Hyclone，美国）；1000U双抗（Invitrogen，美国）；DMSO（Amresco，美国）；BSA（Sigma，美国）；Trizol Reagent（Invitrogen，美国）；RNase free water（Quagen，美国）；无水乙醇、氯仿、异丙醇（分析纯，北京化工厂）；倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；CO2培养箱（Sanyo，日本）；XP205型电子天平（MettlerToledo，瑞士）；密理博超纯水系统（Millipore，美国）；台式冷冻离心机（Hettich，德国）；Biophotometer核酸紫外分析仪（Eppendorf，德国）。
1.2 药物 丹参脂溶性成分本实验室自制（经HPLC进行质量控制）。丹参脂溶性成分的得率为2.4%，主要成分有二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。
2 方法与结果
2.1 细胞培养 HUVECs以含10%胎牛血清、1%双抗的1640培养基在37 ℃，5% CO2的培养箱中进行培养，待细胞达到80%融合度后对其进行传代，取对数期、生长良好的细胞进行实验。
2.2 细胞活性测定 细胞用0.25%的胰酶消化，计数；以5×104个/孔的密度接种于96孔板中，培养24 h后除去培养液，随机分组，分别加入100 μL含不同浓度的丹参脂溶性成分的培养基（药物终浓度为0.5，5，10，20，40，80 mg・L-1，DMSO的最大含量低于0.1%），每组6个复孔，孵育24 h后，MTT（0.5 g・L-1）法测定细胞活性，酶标仪检测波长490 nm，参比波长630 nm测定吸光度。图1为药物作用后细胞活性测定结果，在0～80 mg・L-1，丹参脂溶性成分抑制内皮细胞增殖，并随着浓度的增加，抑制能力逐渐增强。丹参脂溶性成分的半数抑制浓度为38.64 mg・L-1。当丹参脂溶性成分的作用浓度为5 mg・L-1时，对HUVECs增殖活性的抑制率已达到20%以上，因此选择该浓度作为后续考察的作用浓度。
2.3 划痕法测定细胞迁移 取计数后的HUVECs单细胞悬液，按5×104个/孔浓度接种于板底划有横线的24孔板中，待细胞达80%融合后，弃去完全培养基，10 μL枪头在每孔中垂直于底部横线划2条直线，PBS清洗，加入含药培养基（5 mg・L-1的丹参脂溶性成分），放入培养箱中培养，分别在0，6，18，24 h时观察拍照。由图2可知，5 mg・L-1的丹参脂溶性成分在6，18，24 h时的迁移趋势相同，药物显著抑制内皮细胞迁移。
2.4 Transwell法测定细胞迁移 在Transwell 迁移系统（不含Matrigel基质胶）的上层小室中加入200 μL的含有5×104个细胞的含药培养基（0.1%BSA，无血清），下室中加入500 μL含5% FBS的1640培养基，放入培养箱中孵育3 h后，轻轻擦去上层小室中的细胞，PBS清洗，固定，碘化丙啶（PI）溶液染色，荧光显微镜下进行观察，随机选取5个视野进行拍摄（×100倍），IPWI60软件计算每个视野中的细胞数量。图3显示5 mg・L-1丹参脂溶性成分能够显著减弱内皮细胞的迁移能力。划痕法和Transwell法结果均证明丹参脂溶性成分显著抑制内皮细胞的迁移能力。
2.5 Total RNA分离 HUVECs以6×105个/瓶接种于25 cm2的培养瓶中，贴壁培养24 h后，用含丹参脂溶性成分5 mg・L-1的完全培养基培养（DMSO含量低于0.1%）。孵育24 h后，弃去培养基，PBS清洗，加入1 mL Trizol，吹打后移入1.5 mL PV管中，之后按照Trizol试剂说明书进行操作。提取完成后，核酸紫外分析仪检测纯度和浓度，A260/A280均介于1.8～2.1。
2.6 实时荧光定量PCR测定 使用Primer 3.0设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列信息见表1。取2.5 μg 总RNA，按照First Strand cDNA Synthesis Kit提供的方法逆转录合成cDNA。以cDNA 为模板，采用SYBR Green 方法对待测基因VEGF-A，VEGF-C和MMP-9进行实时荧光定量PCR测定。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃扩增30 s，共40个循环。利用绝对定量法，通过构建标准曲线，以管家基因GAPDH为参照物，分析VEGF-A，VEGF-C，MMP-9基因的表达水平。
2.7 VEGF-A和VEGF-C基因表达的变化 血管内皮生长因子（VEGF）是体内、体外血管生成的主要调节因子，促进内皮细胞生长、增殖、迁移和形成血管管型结构，VEGF-A和VEGF-C是VEGF家族中调节血管新生的重要成员[6-7]。由图4可知，与对照组对比，丹参脂溶性成分抑制VEGF-A基因的表达，并具有显著性差异；而在VEGF-C基因的表达中，虽然丹参脂溶性成分能下调VEGF-C的表达，但与对照组相比没有显著性差异。
2.8 丹参脂溶性成分对HUVECs中MMP-9基因表达的影响 基质金属蛋白酶（MMPs）是一种能降解细胞外基质成分和基底膜的含锌蛋白酶。MMP-9属于MMPs家族中的明胶酶类，在降解细胞外基质和内皮细胞的迁移中发挥着重要作用[8-9]。图4显示丹参脂溶性成分显著下调MMP-9的表达。
3 讨论
细胞外基质的降解，内皮细胞的增殖、迁移是血管新生的早期步骤，是新生血管形成的必备环节[10]。本研究应用人脐静脉内皮细胞模型考察了丹参脂溶性成分对血管新生的影响。活性测定显示丹参脂溶性成分抑制内皮细胞的增殖，并呈量效关系；划痕法和Transwell法测定结果显示5 mg・L-1的丹参脂溶性成分抑制内皮细胞的迁移；上述结果表明血管新生的几个关键步骤均受到丹参脂溶性成分的抑制，丹参脂溶性成分可能通过抑制内皮细胞的增殖和迁移来抑制血管新生。VEGF-A，VEGF-C和MMP-9基因直接调节血管内皮细胞的增殖、迁移及细胞外基质降解，是血管生成的关键调控因子，本研究采用RT-PCR技术检测了丹参脂溶性成分作用HUVECs前后VEGF-A，VEGF-C和MMP-9基因的表达变化，结果显示丹参脂溶性成分抑制VEGF-A和MMP-9基因，且与空白组比较具有显著性差异；而VEGF-C基因，虽然丹参脂溶性成分有抑制其表达的趋势，但与空白组相比没有显著性差异。VEGF是通过结合受体发挥生物效应的[11]，VEGF-C与VEGFR-3 受体结合促进淋巴内皮细胞增殖和淋巴管增生，与VEGFR-2 结合，促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成[12]。基因定量研究结果表明VEGF-A是丹参脂溶性成分调节的主要靶点而不是VEGF-C。综上所述，丹参脂溶性成分具有抑制血管新生的作用，可通过抑制VEGF-A，MMP-9基因的表达来抑制内皮细胞的增殖和迁移能力。
[参考文献]
[1] 姜志胜，唐朝. 血管新生及其意义[J].中国动脉硬化杂志，2000，8（2）：178.
[2] Tsai M Y，Yang R C，Wu H T，et al. Anti-angiogenic effect of tanshinone ⅡA involves inhibition of matrix invasion and modification of MMP-2/TIMP-2 secretion in vascular endothelial cells[J]. Cancer Lett，2011，310： 198.
[3] Hur J M，Shim J S，Jung H J，et al. Cryptotanshinone but not tanshinone ⅡA inhibits angiogenesis in vitro[J]. Exp Mol Med，2005，37（2）： 133.
[4] Fan T P，Yeh J C，Leung K W，et al. Angiogenesis： from plants to blood vessels[J]. Trends Pharmacol Sci，2006，27：297.
[5] 池晓霞，高心宇. 丹参调节血管新生及其机制研究进展[J]. 海峡药学，2010，22（2）：3.
[6] 丁宁，崔芳芳，邹检平. 血管内皮生长因子及其功能[J]. 中国计划生育学杂志，2011，19（3）：189.
[7] 王彦敏.血管生成因子VEGF研究进展[J].河北医药，2010，32（11）：1456.
[8] Dabek J，Kulach A，Gasior Z. The role of matrix metalloproteinases in acute coronary syndromes[J]. Eur J Int Med，2007，18：463.
[9] Roy R，Yang J，Moses M A. Matrix metalloproteinases as novel biomarkers and potential therapeutic targets in human vancer[J]. J Clin Oncol，2009，27（31）： 5287.
[10] Bussolino F，Mantovani A，Persico G. Molecular mechanisms of blood vessel formation[J]. Trends Biochem Sci，1997，22：251.
[11] 姚佳红，赵红卫，刘朝奇. VEGF及其受体研究新进展[J]. 现代医药卫生，2003，19（8）：973.
[12] 杨艳，葛荣明. 血管内皮生长因子 C的研究进展[J]. 同济大学学报：医学版，2001，22（3）：67.
Study on inhibitory effects and mechanism of lipophilic components in
Salvia miltiorrhiza on angiogenesis in vitro
FAN Xue-mei1，REN Gui-xiang2，LIANG Qiong-lin1*，WANG Yi-ming1，LUO Guo-an1
（1.Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology under Ministry of Education，
Department of Chemistry，Tsinghua University，Beijing 100084，China；
2.School of Pharmacy，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）
[Abstract] In this study，the human umbilical vein endothelial cell model was used to study the regulating effect of lipophilic components in Salvia miltiorrhiza on angiogenesis，and explore its possible mechanism. The cell model was established to determine the effect of lipophilic components in S. miltiorrhiza on the proliferative activity and migration capacity of endothelial cells. Then the real-time fluorescence quantification PCR technology was applied to detect the changes in the gene expressions of angiogenesis-related cytokines VEGF-A，VEGF-C and MMP-9. The results showed that 5 mg・L-1 lipophilic components in S. miltiorrhiza could inhibit the proliferation and migration of endothelial cells，and reduce the expression of VEGF-A and MMP-9 genes. It indicated that lipophilic components in S. miltiorrhiza may inhibit the proliferation and migration of endothelial cells by inhibiting the expression of VEGF-A and MMP-9 genes，so as to show the inhibitory effect on angiogenesis.
[Key words] lipophilic components in Salvia miltiorrhiza； angiogenesis； human umbilical vein endothelial cells； Real-time fluorescence quantification PCR； vascular endothelial growth factor
doi：10.4268/cjcmm20140437