左卡尼汀对大鼠肝脏热缺血及再灌注损伤的保护作用
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【摘要】目的研究左卡尼汀Υ笫蟾卧嗳热毖及再灌注损伤的保护作用，并探讨其相关机制。方法将48只雄性SD大鼠随机分为三组：假手术（SO）组，肝热缺血及再灌注（WIR）组，左卡尼汀预处理（LC）组，各组内再分为再灌注6 h、12 h亚组。LC组腹腔注射左卡尼汀，SO组及WIR组注射等量生理盐水。检测各组血清ALT和AST水平，测定肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，观察肝组织病理学改变。结果与SO组比较，WIR组6 h、12 h亚组血清ALT、AST水平均明显高于SO组相同时间点亚组，差异有统计学意义（P
【关键词】左卡尼汀；肝热缺血及再灌注损伤；保护作用
中图分类号：R657.3文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.004
【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects of LCarnitine on liver warm ischemia and reperfusion injury （WIRI） in rats，and to explore its possible mechanism.MethodsFortyeight male SpragueDawley（SD） rats were randomly divided into the following three groups：Shamoperated（SO）group，liver warm ischemia and reperfusion（WIR） group and LCarnitine pretreatment（LC）group.Within each group，rats were divided into reperfusion 6h and 12h subgroups.LCarnitine was injected through abdominal cavity in LC group while the equal volume of saline was injected in SO group and WIR group.And then，the levels of serum Alanine aminotransferase（ALT） and Aspartate aminotransferase（AST） as well as the activities of Superoxide dismutase（SOD） and the content of Malondialdehyde（MDA） in liver tissues were detected.Meanwhile，pathological change of liver tissue was observed.ResultsCompared with the SO group，serum ALT and AST levels of 6h and 12h subgroups in the WIR group at the same time point were significantly higher，difference was statistically significant（P
【Key words】LCarnitine；WIRI；protective effects
肝K热缺血及再灌注损伤（warm ischemia and reperfusion injury，WIRI）是肝脏手术中多因素且复杂的病理生理过程，其显著影响疾病的预后、手术成功率及患者的生存[1]。左卡尼汀（Lcarnitine，LC）在平衡抗氧化系统过程中扮演着重要角色，并具有抗过氧化的效果[2]。近年研究报道左卡尼汀在肾缺血再灌注损伤中具有明显保护作用[3]，但其在肝脏WIRI中的作用研究较少。本研究建立大鼠肝脏热缺血及再灌注损伤模型，观察肝功能、肝组织病理学改变及超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的变化，探讨左卡尼汀对大鼠肝脏WIRI的保护作用及其机制。
1材料与方法1.1材料与试剂SPF级雄性SpragueDawley（SD）大鼠48只，体重240～270 g，由右江民族医学院动物中心（许可证号：SCXK桂2012-0003）提供；左卡尼汀注射液购自常州兰陵制药有限公司；组织总超氧化物歧化酶（TSOD）、MDA测试盒购自南京建成生物工程研究所；石蜡切片机（德国HM 315）；紫外分光光度计（中国 UV1750）；全自动生化分析仪（美国贝克曼Beckman LX20）。
1.2方法
1.2.1动物分组及给药大鼠按随机数字表法分为三组，每组16只，分别为假手术（Shamoperated，SO）组、肝热缺血及再灌注（WIR）组、左卡尼汀预处理（LC）组，每组按肝门血管复流时间不同分为6 h、12 h两个亚组（各亚组n=8）。LC组术前30 min每只大鼠予腹腔注射LC 200 mg/kg，SO组、WIR组术前30 min每只大鼠予腹腔注射等量生理盐水。
1.2.2模型的建立大鼠术前禁食 6～8 h，但可适量禁水。称重后采用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。SO组仅常规进腹后，游离但不予结扎肝十二指肠韧带内血管。LC组、WIR组建立大鼠肝脏WIRI模型，于剑突下取腹正中切口长约2.5 cm，打开腹腔后将肠管推向左侧于腹腔外，并用生理盐水纱布覆盖，离断镰状韧带及左右三角韧带，分离肝胃韧带，充分暴露肝门部及肝十二指肠韧带后，游离门静脉及肝固有动脉；3 min后用微血管夹将门静脉和肝固有动脉阻断30 min，造成原位肝热缺血模型；阻断30 min后小心松开微血管夹进行再灌注复流，常规关腹，造成原位肝热缺血及再灌注模型；再灌注 6 h、12 h后，穿刺腹主动脉远端采血并获取肝组织标本。
1.2.3大鼠血清ALT、AST指标检测大鼠血液静置后高速离心（3000 rpm）15 min，留取血清，分装存放于-80℃冰箱保存。将冻存血清解冻混勾后用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氧酶（AST）水平。
1.2.4肝组织病理检查部分肝组织置于10%甲醛溶液中固定24 h后，常规脱水、透明、石蜡包埋后，制成4 μm连续切片，行HE染色。用光学显微镜观察肝组织病理改变。
1.2.5肝组织匀浆SOD活性和MDA含量的检测取适量肝组织制备肝组织匀浆液，离心、提取上清液，通过考马斯亮蓝法蛋白定量测试盒测定蛋白浓度，采用SOD、MDA测试盒测定其活性。严格按试剂盒说明书操作。
1.3统计学方法采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量数据采用（±s）表示，各组之间采用单因素方差分析（ANOVA）进行比较，两两比较采用LSD检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。
2结果2.1大鼠肝组织病理学变化HE染色镜下观察：SO组6 h亚组肝小叶结构大致正常，无肝细胞变性坏死，再生肝细胞少（图1A）；WIR组6 h亚组肝细胞结构紊乱，肝小叶细胞大量水肿，可见肝细胞水变性、脂肪变性及大量坏死，小叶中央静脉淤血、扩张（图1B）；而LC组6 h亚组肝组织损伤较轻，小叶中央静脉轻度扩张，肝小叶内见肝细胞再生修复（图1C）。SO组12 h亚组肝索、肝窦无明显坏死、水肿，无肝细胞变性坏死，再生肝细胞少（图1D）；WIR组12 h亚组肝小叶细胞可见轻度水肿，肝细胞水变性及细胞再生、修复（图1E）；而LC组12 h亚组肝小叶细胞少量水肿，少量炎症细胞，少量肝细胞再生修复（图1F）。A：SO组6 h亚组；B：WIR组6 h亚组；C：LC组6 h亚组；D：SO组12 h亚组；E：WIR组12 h亚组；F：LC组12 h亚组。
2.2大鼠肝脏热缺血再灌注后肝功能变化各组大鼠血清ALT、AST水平比较：与SO组比较，WIR组6 h、12 h亚组血清ALT、AST水平均明显高于SO组相同时间点亚组，差异有统计学意义（P0.05）。与WIR组比较，LC组6 h、12 h亚组血清ALT、AST明显低于WIR组相同时间点亚组，差异有统计学意义（P
2.3肝组织匀浆SOD活性和MDA含量的检测结果各组大鼠肝组织SOD活性和MDA含量比较：与SO组比较，WIR组6 h、12 h亚组肝组织匀浆SOD活性水平均明显低于SO组相同时间点亚组，差异有统计学意义（P
3讨论左卡尼汀是机体合成类似维生素的膳食化合物，它在脂质代谢中起着重要的作用，能活化细胞对长链脂肪酸的摄取进入线粒体基质并进行β氧化供能。左卡尼汀也作为一种抗氧化剂，通过清除羟基自由基和抑制羟基自由基的形成而免受活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的作用[4]。此外，其还可抑制脂质过氧化和对抗氧化应激，从而起到抗氧化活性作用[5]。
本实验发现，WIR组6 h、12 h亚组血清ALT、AST水平显著升高，有肝功能障碍，肝组织病理学发现有明显的形态改变，提示大鼠肝脏WIRI模型诱导成功；与WIR组6 h、12 h亚组相比较，LC组6 h、12 h亚组血清ALT、AST水平显著降低，肝组织病理学形态损伤明显减轻，提示左卡尼汀对大鼠肝脏WIRI具有保护作用，可改善肝功能，减轻肝组织损伤。
氧化应激是肝脏WIRI发病机制的一个重要途径[6]。再灌注早期阶段，ROS是由黄嘌呤氧化酶氧化释放大量电子，被O2接受后形成的[7]，ROS过剩最终导致脂质过氧化反应。肝脏WIRI发生氧化应激时可观察到自由基形成和脂质过氧化产生中间产物，如MDA升高[8]。此外，再灌注过程中过量的ROS可下调某些内源性抗氧化剂表达酶如SOD[9]。在内源性抗氧化防御机制中，SOD能催化超氧化物阴离子转化为H2O2，再由过氧化氢酶转化为H2O和O2，保护机体免受超氧阴离子的影响。这些内源性抗氧化酶活性的提高在一定程度上起着对抗氧化应激的保护作用。本实验发现，WIR组6 h、12 h亚组肝组织SOD活性较SO组6 h、12 h亚组显著下降，而MDA含量显著升高，表明肝脏WIRI后ROS大量生成，ROS聚集可能影响机体抗氧化防御系统，使肝细胞膜改变，肝组织发生脂质过氧化反应，肝组织病理学改变，导致肝功能受损。而LC组6 h、12 h亚组肝组织SOD活性较WIR组6 h、12 h亚组显著升高，而肝组织MDA含量显著降低，提示左卡尼汀可通过增强抗氧化能力，清除ROS，减弱脂质过氧化反应，减轻氧化应激损伤，从而起到保护肝功能和肝组织的作用。
总之，左卡尼汀对大鼠肝脏WIRI的氧化应激损伤可以通过提高抗氧化防御系统和抑制脂质过氧化反应而起到保护作用。但左卡尼汀对肝脏的保护作用可能是多方面的，其作用机制值得进一步探讨。参考文献[1]Yang J， Sun H，Takacs P，et al.The Effect of Octreotide on Hepatic IschemiaReperfusion Injury in a Rabbit Model[J].Transplantation Proceedings，2013，45（6）：24332438.
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（收稿日期：2016-07-29修回日期：2016-10-23）