猪血血红蛋白素的保存期运用研究
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本文作者：周剑 谢志镭 单位：上海食品研究所
亚硝酸盐在肉制品加工中作为发色剂被广泛使用，但由于其毒性和生成的亚硝胺的致癌性[1]，人们一直致力于寻找替代亚硝酸盐的方法[2]。目前，以畜禽血液为原料制备的亚硝基血红蛋白类色素因其发色效果良好和安全性而多为研究热点[3-4]，但是该类色素的稳定性尚不理想，见光、遇氧易氧化[5-6]，而且研究显示血红蛋白存在别构效应，即一分子氧与血红蛋白一亚基结合后会导致其构像改变，从而促进更多（2~4个）的氧与其它亚基结合，导致氧化加速生成褐色的高铁血红素[7]。因此该类色素目前为止还未实际应用于肉制品加工中。前期所制备的亚硝基血红蛋白亚基色素是血红蛋白经过解聚和亚硝基化后形成的单体产物，其亚基间的氧化并不会相互促进，因此氧化速度慢于多聚体结构的亚硝基血红蛋白色素，前期试验也证实了该亚基色素有着较好的稳定性[8]。所以，开发该亚基色素产品更具优势。另外，目前的研究多针对亚硝基血红蛋白类色素的合成和应用[3-4]，对其稳定保存期限的研究却相对较少，这对该类产品的实际应用造成一定影响。因此，以猪血制备的亚硝基血红蛋白亚基色素为研究对象，研究该色素稳定保存期限以及其在肉制品中的发色稳定性，旨在为亚硝基血红蛋白亚基色素的合理保存和产品应用提供一定的参考依据。该色素的实际应用可望从根本上解决肉制品着色这一难题，实现肉制品的低硝化、无硝化，为我国放心肉工程提供一种新型食品添加剂，并且能有效地利用动物血液副产品，减少牲畜屠宰企业的三废排放量，从而提高企业的经济效益。
1材料与方法
1.1材料亚硝基血红蛋白亚基色素，实验室自制；亚硝酸钠，分析纯，上海精胜精细化工科技有限公司；大豆分离蛋白，上海德津实业有限公司；猪肉、淀粉、食盐、糖、三聚磷酸钠，均为市售产品。
1.2仪器与设备754pc型紫外可见光分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SCHARFENTC11型斩拌机：上海高乐食品技术有限公司；PL6001-L型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SC-80C全自动色差计：北京康光仪器有限公司；冷藏柜：上海金城制冷设备有限公司；KM020多功能料理机：英国kenwood公司；DW-40W100低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；ChristD37520真空冷冻干燥机：德国MarinChrist公司。
1.3方法
1.3.1亚硝基血红蛋白亚基色素的制备采集新鲜血液洗涤去杂离心除血浆溶血破壁离心除细胞壁硫酸铵沉淀蛋白解聚超滤脱盐亚硝化超滤浓缩
1.3.2色素的保存样品1：铝箔袋密封包装的液体色素经80℃巴氏杀菌15min后，于4℃冰箱中避光冷藏；样品2：铝箔袋密封包装的液体色素在-29℃冷柜中储藏；样品3：经真空冷冻干燥48h后所得固体粉末样品，经真空包装后置于4℃冰箱中避光保藏。
1.3.3色素稳定性研究
1.3.3.1光谱扫描法将不同保存条件下的色素每隔相应时间，用水稀释200倍，于分光光度计450~650nm处进行光谱扫描。
1.3.3.2菌落总数测定GB／T4789.2-2003检验方法按《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》所制定的方法测定。每组做两个平行，取平均值。
1.3.3.3肉制品的发色试验每隔相应时间在盐水火腿中添加所制色素，观察其发色效果，从而判断色素的好坏。盐水火腿基本配方见表1，制作工艺大致如下：原料肉整理斩拌辅料混匀添加色素蒸煮
1.3.4色素所制肉制品的色泽稳定性研究1.3.4.1肉制品颜色的测定用色差计来测量肉制品的L*值（亮+/暗-）；a*值（红+/绿-）；b*值（黄+/蓝-）[9]。在肉表面3个不同位置测定L*、a*、b*值，取平均值。以标准白瓷板做空白。肉制品色差用E表示：E=[(L1-L0)2+(a1-a0)2+(b1-b0)2]1/2（1）
1.3.4.2肉制品质量的测定方法根据GB2726-2005《熟肉制品卫生标准》所制定的方法测定。
1.3.4.3肉制品保质期内的颜色变化通过每周测定盐水方腿表面和里层的L*、a*、b*值，来判断肉制品贮藏期内的颜色变化。
2结果与分析
2.1色素稳定性研究
2.1.1光谱扫描法光谱特性可以反映出血红蛋白的结构性质，吸光度峰值的高低可以反映样品的含量。根据Shahidi等人报道，亚硝基血红蛋白在540nm处有吸收峰[10]，由图1、2、3可见，所得样品确有亚硝基血红蛋白结构生成，并且冷藏、冷冻和冷冻干燥样品的吸光度曲线在保质期内并无明显差异，说明这三种不同保存方法的亚硝基血红蛋白亚基样品在相应时间内的结构和含量均无明显变化。而真空冷冻干燥样品初期的吸收峰略小于冷藏样品和冷冻样品，这有可能由于冷冻干燥过程存在应力损伤，导致部份蛋白质变性，含量减少，但是在后期储存过程中吸光度曲线也无明显差异。
2.1.2菌落总数测定由图4可知，不同保存方式的样品的微生物情况都较好，在保质期内菌落总数都较低，说明冷藏样品前期的巴氏杀菌效果较好，而冷冻样品结果显示低温冷冻对微生物生长有良好的抑制作用，另外冷冻干燥样品由于干燥后失去了水分，细菌也较难生长。
2.1.3肉制品的发色效果根据每月的肉制品发色试验（配方见表1），冷冻色素样品和冷冻干燥样品在6个月内发色效果稳定，熟肉制品颜色红润；而冷藏样品第三个月后发色效果较差（表2）。结合光谱扫描和菌落总数测定的结果（3个月后冷藏样品的亚硝基血红蛋白含量无明显变化，微生物情况也较好），推测其发色效果不佳可能由于血色素中的亚铁原子氧化成了高铁，而高铁血红蛋白呈褐色[11]，因此呈色不佳。而显然，冷冻样品在低温下氧化受到抑制，而经冷冻干燥处理后的色素由于真空包装也不易氧化，因此发色效果稳定。结合以上三组试验可知，储存在4℃下的色素的保质期为2个月，最佳使用期为1个月；储存在-29℃的色素和真空冷冻干燥色素的保质期可达6个月之久。
2.2色素所制肉制品的色泽稳定性研究
2.2.1肉制品颜色的测定通过测定自制方腿与市售产品的L*、a*、b*值，并结合感官评定，来比较颜色差别。结果显示单纯添加亚硝基血红蛋白亚基色素的自制方腿1的颜色为淡红色，红值a*较市售产品低，产品虽然呈现天然的肉红色，但是对于习惯了由于添加过多色素而色泽鲜艳的产品的消费者来说，该配方较不易被接受；而单纯添加胭脂虫红色素的自制方腿2，其红色过于鲜艳，人为添加色素痕迹过浓；最后采用了胭脂虫红色素和亚硝基血红蛋白亚基色素的搭配，得出了较为理想的方腿颜色（自制方腿3），其颜色与市售产品较为接近（见表3），两者色差E仅为1.73，其红色自然柔和，自制色素改善了胭脂虫红色素单一、鲜艳的红色，感官上更易被接受。结果证实，采用了胭脂虫红和自制色素的肉制品颜色完全可以达到或超过市售产品的颜色标准，并且由于不添加亚硝酸钠发色，安全性上更具优势。
2.2.2自制方腿质量的测定自制方腿3经检验，完全达到了GB2726-2005《熟肉制品卫生标准》所制定的质量标准，其中亚硝酸钠的残留量＜1.0mg/kg，远低于市售亚硝酸钠腌制产品，达到了降低肉制品中亚硝酸盐残留量的目的。
2.2.3自制方腿保质期内的颜色变化通过每周测定自制方腿3的L*、a*、b*值，来测定肉制品保质期内的颜色变化，以判断色素在肉制品中的发色稳定性。结果显示（图5、6、7），自制方腿表层的L*、a*、b*值在6星期内无较大变化，说明保质期内颜色稳定。同样，肉眼观察方腿的色泽也保持红润。方腿里层的L*、a*、b*初始值与表层并无明显差异，但是在第二个星期后里层的L*值和a*值出现变化，L*由55.13上升为57.35，a*值18.27下降至15.94，而在随后的时间内变化平缓。初步判断这是由于方腿出品后冷却降温不匀，导致方腿内部高温时间过长，色素降解致使内部颜色褪色。通过快速冷却，可以解决肉制品里层颜色变化的问题。结果显示，添加了胭脂虫红和自制色素的方腿在保质期内可以保持颜色稳定。因此，在熟肉制品中搭配使用这两种色素是可行的。
3结论与讨论
当前，在亚硝酸钠的替代物研究中，以血红蛋白为原料生产腌制色素是充分利用禽畜血液和降低肉制品亚硝酸盐残留量的有效途径，但国内外现有的亚硝基血红蛋白类色素的稳定性尚不理想。Shahidi等证实亚硝基血红蛋白色素溶液见光、遇氧易氧化，不宜贮藏[12-13]。目前，多采用微胶囊化[14]和糖基化[15]来提高亚硝基血红蛋白色素稳定性。胶囊化和糖基化均使亚硝基血红蛋白的分子结构中形成了空间位阻，阻止氧进入血红蛋白的卟啉环，避免了铁的氧化。但微胶囊包埋色素水溶性较差，因此在生产实践中很少应用，而糖基化反应势必会增加色素的额外成本。反应产物——亚硝基血红蛋白亚基色素是通过消除血红蛋白亚基间氧化的别构效应来提高稳定性。由于血红蛋白与O2结合前，其构象处于紧张态，各亚基对O2的亲和力比较低，不易与O2结合。而一旦其中一个亚基与O2结合，亚基间的盐桥便被逐步破坏，亚基间的聚合变得疏松，使整个分子处于松弛态，有利于与O2的结合，因此血红蛋白与O2的结合是正协同促进的[16]，而血红蛋白过快的氧和也就导致亚铁血红素很容易被氧化成褐色的高铁血红素，以致色素失效。通过解聚蛋白产生的单体色素，个体间的氧和并不相互影响，所以氧化速度慢于多聚体结构的亚硝基血红蛋白，在提高稳定性的同时也不影响色素的水溶性及生产成本。也证实于-29℃冷冻储存下的液体色素和真空冷冻干燥色素的保质期可达6个月以上，在肉制品保质期内颜色也能保持稳定。另外，肉制品发色试验显示该亚基色素同样能够赋予肉制品自然的肉红色，这是由于亚硝基血红蛋白亚基与肌肉中发色的亚硝基肌红蛋白结构相同[7]，因此色调一致，在一些肌红蛋白含量低的肉制品中，如鸡肉、猪肉等，该色素更为适用。而在搭配胭脂虫红色素后，所得方腿颜色更为红润、自然，与市售产品较为接近，易被消费者接受。并且肉制品经检验，各项指标均符合质量标准。因此，该亚基色素完全能够替代亚硝酸钠作为肉制品理想的着色剂。上述研究为亚硝基血红蛋白亚基色素产品的市场化应用提供了理论依据，而随着人们对食品安全性的要求逐渐增长，无硝色素的应用与发展将具有广阔前景。