抑制AMPK激活对脑缺血小鼠行为学和脑梗死体积的影响
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【摘要】 目的：探讨抑制磷酸腺苷活化蛋白激酶（ampk）激活对脑缺血小鼠行为和脑梗死体积的影响。方法：选取雄性昆明小鼠66只，随机分为假手术组、盐水对照组及药物干预组，每组22只。药物干预组在缺血时腹腔注射AMPK特异性抑制剂Compound C（20 mg/kg），采用线栓法制作大脑中动脉栓塞/再灌注模型，盐水对照组在相同时间给予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射，假手术组不给予任何药物。再灌注24 h后对小鼠进行神经功能评分，TTC染色观察脑梗死体积，Westem-Blot法检测缺血侧大脑中pAMPK蛋白表达。结果：假手术组无神经功能缺损和脑梗死灶，脑组织有少量pAMPK蛋白表达，包括皮质（0.700±0.197）和海马（0.690±0.228）；脑缺血再灌注损伤后，盐水对照组小鼠神经功能评分（2.63±0.52）分，脑梗死体积（49.57±9.71）%，缺血侧脑组织pAMPK蛋白包括皮质（1.410±0.322）和海马（1.510±0.418），均较假手术组增高（P
【关键词】 脑缺血再灌注损伤； 磷酸腺苷活化蛋白激酶； 神经保护
The Impact of Inhibiting Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase on the Behavior and Cerebral Infarction Volume of Mice after Cerebral Ischemia/MA Yu，DANG Hui，BU Juan，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（28）：001-006
【Abstract】 Objective：To discuss the impact of inhibiting adenosine monophosphate activated protein kinase（AMPK） on the behavior and cerebral infarction volume of mice after cerebral ischemia.Method：Sixty-six male Kunming mice were randomly divided into the sham operation group，saline control group and drug intervention group，each group had 22 mice.The AMPK specific inhibitor Compound C（20 mg/kg）was injected intraperitoneally in the drug intervention group during the time of ischemia，the middle cerebral artery occlusion/reperfusion model was made by thread embolism method，saline control group was given intraperitoneal injection of normal saline at the same time and the sham operation group did not give any drugs.After reperfusion for 24 h，the neurological function score was evaluated in mice，TTC staining was used to observe the volume of cerebral infarction and Westem-Blot method was used to detect the expression of pAMPK protein in the ischemic side of the brain.Result：There were no neurologic impairments and cerebral infarctions in the sham operation group，there was a small amount of pAMPK protein expression includes cortex（0.700±0.197） and hippocampus（0.690±0.228）.After cerebral ischemia reperfusion injury，the neurological function score were（2.63±0.52） in the saline control group，the volume of cerebral infarction was（49.57±9.71）%，ischemia side brain tissue pAMPK protein includes the cortex（1.410±0.322） and the hippocampus （1.510±0.418），were higher than those of the sham operation group（P
【Key words】 Cerebral ischemia reperfusion injury； AMP-activated protein kinase； Neuroprotection
First-author’s address：The People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.28.001
脑梗死（cerebral infarction，CI）是指多种因素引起脑部血流受阻，相应血供障碍的脑组织出现不可逆损伤，最终导致局部脑组织发生缺血缺氧性坏死，是常见于中老年人的脑血管疾病，脑梗死占所有脑卒中的87%[1]。脑血管堵塞引发复杂的缺血诱导事件，包括细胞能量耗竭、代谢应激、离子稳态失衡、兴奋性氨基酸毒性、梗死灶周边去极化、脂质过氧化、错误蛋白合成、DNA损伤和细胞凋亡等[2-3]。缺氧引起细胞代谢急剧下降，抑制相关能源依赖途径，破坏神经胶质细胞膜、血管内皮和脉络膜内皮间稳定的溶质梯度，以上最终导致不可逆神经损伤[4]。脑梗死是能量衰竭始发的能量代谢障碍性疾病，能够感知能量失衡的分子对减轻脑缺血损伤至关重要[5]。
磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是异质三联体，包含α催化亚基（α1、α2）和β、γ调节亚基（β1、β2、γ1、γ2、γ3），通过α亚基上苏氨酸-172的磷酸化被激活[6-7]。AMPK是许多生物（从酵母到哺乳动物）关键的能量监控器，也是细胞能量平衡的关键调节器，当细胞能量供应缺乏时，AMPK被激活[8-9]。在细胞水平，激活AMPK通过抑制消耗ATP的合成代谢途径，同时激活产生ATP的分解代谢途径维持能量储备，启动级联反应确保代谢适应和细胞生存力[10]。在外周，AMPK调节细胞新陈代谢，减少能量储备，增加能量利用，为能源不足细胞提供ATP[11]。此外，AMPK也是主要代谢转换器，控制细胞和整体能量平衡，有研究表明AMPK通过与线粒体生物发生、蛋白质合成和降解途径的相互作用在细胞生长中发挥重要作用[12]。因此，已将靶向AMPK治疗糖尿病、肥胖、癌症和心血管病等多种疾病。中枢神经系统神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞中均有AMPK表达，AMPK在中枢神经系统广泛分布的特点为其成为有效神经保护靶标提供重要生物学基础[13-15]。有研究已经提出AMPK代表内源性的神经保护通路，该信号通路在脑卒中病理生理过程中发挥重要作用[16]。在本研究中，笔者制作小鼠脑缺血再灌注模型，检测缺血侧脑组织中AMPK蛋白表达，观察抑制AMPK后小鼠的行为结局和脑梗死体积，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物分组和处理 清洁级健康成年雄性昆明小鼠66只，体重25～30 g，由新疆实验动物研究中心提供（许可证号：SCXK新2011-0001）。按照随机数字表法将其分为假手术组、盐水对照组（脑缺血再灌注损伤模型组）、药物干预组（Compound C给药组），每组22只。药物干预组小鼠在造模、线栓刚插入时立即腹腔注射AMPK特异性抑制剂Compound C，即6-{4-[2-（1-哌啶基）乙氧基]苯基}-3-（4-吡啶基）吡唑并[1，5-A]嘧啶20 mg/kg（美国Sigma公司），盐水对照组在相同时间点给予等量生理盐水腹腔注射，假手术组则不予任何药物[17]。
1.2 方法
1.2.1 制作动物模型 采用改良线栓法制作短暂性右侧大脑中动脉栓塞模型[18]。应用氯胺酮复合麻醉剂（氯胺酮、安定、阿托品按2∶1∶1配伍，0.9%氯化钠注射液稀释至15 mL，新疆医科大学一附院动物实验研究中心）以1.5～2 mL/kg体重腹腔注射麻醉小鼠。沿颈部正中线纵行剪开2 cm切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，在颈外动脉远端距分叉处约6 mm处斜剪一切口，将0.22 mm硅胶线栓（北京沙东生物技术有限公司生产）缓慢插入，沿颈内动脉向前推进约10 mm，有轻微阻力时则停止进入，此时开始记录缺血时间，缺血60 min后，缓慢拔出线栓恢复血流再灌注，缝合手术切口。小鼠清醒后出现对侧肢体偏瘫，表示模型制作成功。假手术组仅分离颈总、颈外和颈内动脉，不插入线栓，术中控制小鼠体温在37 ℃左右。
1.2.2 神经功能评分 再灌注24 h后，按Longa等[19]方法对各组小鼠进行神经功能评分。评分标准如下：0分：无神经功能缺损征象；1分：缺血对侧前肢内收；2分：行走时向瘫痪侧转圈；3分：行走时向瘫痪侧倾倒；4分：不能自发行走、意识丧失或死亡。1～3分为模型成功，0、4分及出现癫痫发作、取材时发现脑出血者均予剔除并随机补充。
1.2.3 脑梗死体积测定 再灌注24 h后，颈椎脱臼法处死小鼠，速取脑组织，置入-20 ℃冰箱速冻10 min，离额极2 mm向后连续等距切取4个冠状脑片，间距2 mm，将切片放进1%的 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美国Sigma公司）磷酸盐缓冲液中，37 ℃恒温箱避光孵育20 min，再在4%多聚甲醛（美国Gibco公司）液中固定2 h，数码相机照相。正常脑组织染成红色，梗死组织为白色。采用Image pro plus 5.0软件测量梗死面积，计算梗死灶体积：V=∑（S1+S2）×d/2，V为总体积；S1、S2分别表示切片头侧和尾侧面积；d为切片厚度。为除去患侧脑水肿因素，脑梗死体积（%）=脑梗死体积/非梗死侧大脑半球体积×100%。
1.2.4 Westem-Blot法检测缺血侧脑组织中AMPK和磷酸化的AMPK（pAMPK）蛋白表达 再灌注24 h后，处死小鼠，速取脑组织在冰上分离缺血侧脑皮质和海马，分别置于细胞裂解液中低温匀浆、离心、取上清，置-80 ℃冰箱保存。用BCA蛋白定量试剂盒（江苏海门碧云天生物试剂有限公司）测定蛋白浓度，行SDS-PAGE电泳，再用蛋白转移装置将蛋白转移到PVDF膜上。AMPK、pAMPK（Thr172）和β-actin用相应抗体检测，β-actin为内参照。加入一抗[pAMPK（Thr172）（1∶1000，美国CST公司）、AMPK（1∶1000，美国CST公司）、β-actin（1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司）]溶液，4 ℃孵育过夜，将PVDF膜移入TBST溶液（包含4%牛血清白蛋白和0.1% Tween-20）中，室温下轻振荡10 min；再将膜置于二抗[羊抗兔IgG（1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司）]溶液中孵育，最后用ECL化学发光试剂盒（江苏海门碧云天生物试剂有限公司）显色。测定每一条带灰度值，用pAMPK（Thr172）灰度值/AMPK灰度值表示pAMPK蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，以P
2 结果
2.1 小鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧脑组织中pAMPK蛋白表达 假手术组小鼠脑组织中有少量pAMPK蛋白表达，包括皮质（0.700±0.197）和海马（0.690±0.228），盐水对照组包括皮质（1.410±0.322）和海马（1.510±0.418），和假手术组相比pAMPK蛋白表达明显增加，比较差异有统计学意义（皮质：P=0.000；海马：P=0.000）；给予20 mg/kg Compound C干预后，可显著抑制pAMPK蛋白水平，包括皮质（0.930±0.229）和海马（0.960±0.378），与盐水对照组比较差异有统计学意义（皮质：P=0.005；海马：P=0.017）。三组间比较皮质和海马pAMPk蛋白表达比较差异均有统计学意义（F1=12.000，F2=8.530；P1=0.001，P2=0.003），各组小鼠脑皮质和海马区pAMPK蛋白表达见图1、2。
2.2 神经功能评分 假手术组小鼠未出现神经功能缺损症状，评分0分；盐水对照组小鼠可见明显神经功能缺损症状，如Horner征，左侧前肢无力，行走时身体向左侧旋转，甚至彻底向左侧跌倒或不能行走，提尾时左前肢屈曲，评分（2.63±0.52）分；药物干预组小鼠仅出现轻微神经功能缺损症状，表现不能完全伸展左侧前爪或爬行时向左侧倾斜，评分（1.88±0.64）分。药物干预组神经功能评分与盐水对照组比较显著降低，比较差异有统计学意义（P=0.005）。三组间比较差异有统计学意义（F=64.658，P=0.000），各组小鼠神经功能评分见图3。
2.3 脑梗死体积 再灌注24 h后，假手术组小鼠TTC染色脑组织完全红染，无肉眼可见梗死灶，组织结构清晰；盐水对照组和药物干预组小鼠TTC染色后均可见脑组织苍白色梗死灶，内部结构消失，肿胀明显，部位主要累及大脑中动脉供血区（包括皮质和海马），脑梗死体积分别为（49.57±9.71）%与（24.07±7.74）%，与盐水对照组比较，药物干预组脑梗死体积显著缩小，比较差异有统计学意义（P=0.006）。三组间比较差异有统计学意义（F=39.959，P=0.000），各组小鼠脑组织TTC染色及脑梗死体积比较分别见图4、5。
3 讨论
缺血性脑卒中是一个严重的能量缺乏状态，乳酸积聚、自噬和再灌注期间失调的葡萄糖转运蛋白导致的葡萄糖增加都会加重卒中损伤，在缺血缺氧性脑损伤早期，以能量代谢障碍为中心环节[11]。磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是关键的应激与代谢感受器，涉及许多调解途径，位于多个代谢通路的交叉点，对于调解能量平衡有非常重要的作用，故AMPK在缺血性脑卒中中的重要性已逐渐得到重视[20]。
笔者应用小鼠脑缺血再灌注模型，在缺血1 h、再灌注24 h后，应用Westem-Blot法检测小鼠缺血侧脑组织中pAMPK蛋白表达，结果显示pAMPK蛋白水平显著升高，即AMPK被过度激活，小鼠出现明显神经功能缺损症状，大片脑梗死灶形成，说明AMPK激活在缺血脑中是有害的。
脑梗死发生时，氧糖缺乏导致神经元细胞遭受兴奋性毒性和氧化损伤，在修复损伤过程中，许多能量消耗过程（如一连串的氧化和细胞死亡路径）被激活，这些途径过度激活导致完全的能量衰竭，ATP减少，同时AMP增加，能量衰竭是启动脑梗死神经元损伤的主要因素。AMPK通过AMP感觉能量水平变化，激活能源恢复过程，抑制能源消耗过程，通过调节一系列分解代谢和合成代谢过程适应细胞的新陈代谢[21]。然而，作为机体针对缺血应激的代偿性反应，有研究指出过度的AMPK激活可能在应激条件下具有不利作用[22]。缺血情况下，脑组织ATP供应不能满足需要，ATP/AMP降低，AMPK在脑中迅速激活，最初的AMPK激活旨在恢复缺血脑中的能量平衡，然而细胞死亡启动后，试图进一步从代谢受损的细胞中产生ATP只会导致损伤恶化和更严重的代谢障碍，AMPK激活可促成病理条件下（包括卒中和AD）的神经元细胞死亡[23-24]。AMPK是糖酵解强烈刺激素，大脑中AMPK作为能量感受器，在应对增加的代谢应激时激活糖酵解，进而在缺血脑卒中产生乳酸盐，缺血诱导的AMPK激活通过增加卒中诱导的乳酸酸中毒加重卒中损伤[25-26]。有研究表明，NMDA或谷氨酸兴奋性毒性引起初级皮层或小脑颗粒细胞中AMPK激活，长时间的AMPK活化可同时激活ATP相关的细胞死亡过程――兴奋性毒性的凋亡，增加促凋亡Bcl-2家族成员bim（参与凋亡和线粒体去极化的关键蛋白）的转录活性，导致神经元生存力逐步丧失[27]。AMPK活性增加是启动自噬级联反应的关键信号，可以激活自噬，研究表明自噬促进缺血后神经细胞死亡[28-29]。
为了解抑制AMPK激活在缺血脑卒中的效应，笔者给予AMPK特异性抑制剂Compound C干预，结果显示缺血侧脑组织中pAMPK蛋白表达显著减少，即抑制了AMPK激活。另外，小鼠神经功能评分显著降低，脑梗死体积明显缩小，表明在缺血条件下抑制AMPK激活可以减轻脑卒中损伤。以上结果强烈支持笔者关于抑制缺血脑卒中AMPK过度活化发挥神经保护效应的假设。
Zhang等[30]发现在H2O2处理的SH-SY5Y细胞中AMPK和pAMPK的表达显著上调，这是一个自我代偿反应，减少能量利用，增加能量产生。然而，体外过度AMPK激活对SH-SY5Y细胞是有害的，抑制AMPK激活可以抑制氧化应激，增加细胞抗应激能力。另外，有研究证实谷氨酸在HT22细胞中诱导AMPK活性增加，AMPK活化促成谷氨酸氧化毒性诱导的神经元细胞死亡，抑制AMPK激活能保护神经元免受氧化毒性损伤[31]。当沙鼠前脑缺血后，海马CA1区中AMPK被瞬时磷酸化，抑制AMPK激活通过减少海马CA1区中ATP损耗和乳酸积聚保护神经元免受缺血缺氧性损伤[32]。在缺血性脑卒中急性能量缺失阶段，抑制AMPK活性可能诱导一种“神经元冬眠”形式，和低温的作用机制一样，减少能量需求和随后的代谢衰竭，可能延长再灌注治疗的时间窗[33]。AMPK激活导致Kif5轴突动力蛋白驱动蛋白轻链磷酸化，破坏了它和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）的联系，故PI3K不能靶向轴突末梢，使轴突极化和生长被抑制[34-35]。AMPK激活抑制缺血事件后的轴突发生，急性抑制AMPK激活则对卒中发挥保护作用。AMPK信号参与脑缺血预处理，温和短暂的代谢应激通过缓慢减少AMPK活性导致神经元发生代谢耐受效应[36]。文献[37]指出，在小鼠局灶性脑缺血模型中，脑组织中AMPK活性增加，基因敲除法抑制AMPK活性具有神经保护作用，这与本研究结果一致。
综上所述，AMPK活性增强对脑组织的作用是复杂的，AMPK激活的持续时间是卒中结局的关键决定因素[38]。笔者研究证实缺血性脑卒中后立即抑制卒中诱导的AMPK过度活化能够减轻脑卒中损伤，具有显著神经保护作用，建议AMPK可能是缺血性脑卒中治疗的一个有前景的新靶点。
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（收稿日期：2016-06-16） （本文编辑：李颖）