地黄益智方对D-半乳糖衰老模型大鼠脑组织SA-β-gal活性的影响

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（上海中医药大学附属龙华医院， 上海 200032）

摘 要：目的：探讨抗衰老中药方剂地黄益智方对d-半乳糖衰老模型大鼠脑组织sa-β-gal表达的影响。方法：D-半乳糖法诱导大鼠衰老，地黄益智方中药治疗，组织化学法检测大脑衰老标志产物SA-β-gal活性。结果：D-半乳糖作用后大鼠脑组织呈现SA-β-gal阳性，地黄益智方能抑制衰老大鼠脑组织SA-β-gal活性。结论：地黄益智方可抑制衰老大鼠脑组织细胞衰老，提示地黄益智方可延缓脑衰老。

关键词：地黄益智方；脑衰老；细胞衰老

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717（2011）03-0547-03

Effects of Dihuang-Yi-Zhi Formula on Activities of Senescence-associated

β-galactosidase in D-galactose Induced Senile Rats

AN Hong-mei, SHI Yun-feng,HU Bing, SHI Xiu-feng，XU Li-wen Xu，GU Ming-chang

（Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）

Abstract:Objective:To observe the effects of Dihuang-Yi-Zhi formula, an anti-age Herbal Prescription, on activities of senescence-associated β-galactosidase in D-galactose induced senile rats. Methods:Senile rats were induced by D-galactose, and treated with three different doses of Dihuang-Yi-Zhi formula. Senescence-associated β-galactosidase （SA-β-gal）, a marker of cell senescence, was detected by histochemistry. Results:SA-β-gal activities were detected in brain tissue of senile rats induced by D-galactose. Treatment with Dihuang-Yi-Zhi formula resulted in inhibition of SA-β-gal activities. Conclusion:Dihuang-Yi-Zhi formula was effective in inhibiting cell senescence in brain tissue of D-galactose induced senile rats, which suggests Dihuang-Yi-Zhi formula may delay brain aging.

Key words:Dihuang-Yi-Zhi formula； brain aging； cell senescence

祖国医学认为，肾与脑关系密切，脑为髓海，肾藏精生髓充脑。衰老机体肾精不足，髓海空虚，脑失其养，造成衰老相关脑病的发生。地黄益智方具有补肾生髓，醒脑开窍的功效，我们在前期研究证实可提高D-半乳糖衰老模型大鼠学习记忆能力、抗氧化能力及对细胞衰老、细胞周期也显示出一定调控作用的基础上，本研究在整体上研究了地黄益智方对大鼠脑组织细胞衰老的影响，进一步充实祖国医学对肾为先天之本、肾主藏精及肾精充养脑髓理论的认识。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠54只，3月龄，体重（250±50）g，雄性，SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK（沪）2003-0003。

1.2 药物

地黄益智方由熟地等药物组成，由上海中医药大学附属龙华医院药剂科提供生药并负责煎制，药液浓缩至0.60、1.20、2.40g/mL 3种规格，4℃保存备用。天保宁：浙江康恩贝制药有限公司，批号20061001，用蒸馏水配制成7mg/mL的液体溶液。

1.3 试剂

D-半乳糖，购自美国BBI公司；SA-β-gal检测试剂盒，9860，Cell Signal Technology公司，美国。

1.4 仪器

IX71Olympus荧光倒置显微镜，日本Olympus公司。

1.5 方法

1.5.1 衰老模型大鼠的制备及给药 将54只雄性SD随机分为6组：A.正常组；B.模型组；C.天保宁组；D.地黄益智方低剂量组；E.地黄益智方中剂量组；F地黄益智方高剂量组。每组9只动物，适应性喂养一周后，参照相关文献［1-2］复制衰老模型：除正常组外，各实验组动物皮下注射D-半乳糖120mg・kg-1・d-1，同时天保宁组灌服天保宁200mg・kg-1・d-1（2倍等效剂量），地黄益智方低剂量组灌服制备药液6g・kg-1・d-1（等效剂量），地黄益智方中剂量组灌服制备药液12g・kg-1・d-1（2倍等效剂量），地黄益智方高剂量组灌服制备药液24g・kg-1・d-1（4倍等效剂量），正常组和模型组灌服蒸馏水，每只大鼠的灌胃体积均为4mL，每天1次，连续45天。各实验组大鼠均在末次给药（第45日）后2h统一采集标本，取一侧大脑半球置于中尔马林液中固定，余脑组织液氮中保存备用。

1.5.2 脑组织细胞衰老检测取10%中尔马林液中固定的脑组织流水过夜。Leica自动脱水机脱水透明，浸蜡包埋，制作切片。矢状切片，片厚4μm，每5张选1张切片。切片常规脱蜡至水，PBS洗涤3次后加入SA-β-gal 孵育液（1mg/mL X-gal，PH6.0 40mmol/L柠檬酸钠，5mmol/L亚铁氰化钾，5mmol/L铁氰化钾，150mmol/L氯化钠，2mmol/L氯化镁），37℃反应过夜，伊红复染1min，镜下观察阳性染色细胞。

1.6 图片处理及数据统计分析

测量脑组织细胞衰老染色切片大脑皮质区连续3个视野内阳性细胞的细胞核直径（μm），然后在Olympus IX71显微镜高倍镜（40×10）下分析上述相同视野中细胞及细胞核阳性蛋白的表达强度（光密度值），均取均数代表一个样本的脑细胞衰老状态。切片染色图片运用图像分析软件Image-pro Plus 6.0分析，结果进行半定量统计分析。实验数据采用统计软件SPSS 13.0统计分析，组间数据比较采用方差分析统计学方法。

2 结 果

各实验组动物脑组织内SA-β-gal均有表达，模型组阳性细胞染色深，边界清楚，形状不规则，以长梭形和圆形为主，正常组、天保宁组及地黄益智方低中高剂量组细胞染色浅，边界模糊，斑片状。与模型组相比，正常组、天保宁组及地黄益智方低中高剂量组大鼠脑细胞SA-β-gal染色光密度值低、阳性表达细胞核直径小，统计学差异显著（P＜0.05）；与天保宁组相比，正常组大鼠脑细胞SA-β-gal染色光密度值小、阳性表达细胞核直径小，地黄益智方低中高剂量组大鼠脑细胞SA-β-gal染色光密度值高、阳性表达细胞核直径大，正常组大鼠脑细胞SA-β-gal光密度值与天保宁组存在差异（P＜0.05），地黄益智方低中高剂量组除地黄益智方高剂量阳性表达细胞核直径，余均与天保宁组差异显著（P＜0.05）；与正常组相比，地黄益智方低中高剂量组大鼠脑细胞SA-β-gal染色光密度值高、阳性表达细胞核直径大，均差异明显（P＜0.05）；地黄益智方低中高三个剂量组大鼠脑细胞SA-β-gal染色光密度值彼此差异不显（P＞0.05），阳性表达细胞核直径彼此差异显著（P＜0.05）。见图1～2。

3 讨 论

机体的衰老源于细胞的衰老，细胞衰老以衰老相关-β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase, SA-β-gal）为代谢标志［3］。细胞衰老的进展为机体衰老研究提供了新的线索，目前对细胞衰老的研究多集中于端粒、细胞周期调控研究，多限于体外信号通路的研究，在动物体内，从整体水平探讨细胞衰老对机体的调控报道较少，尤其是中医药，因此本研究从细胞衰老的角度出发，结合中医肾－脑理论进行了初步研究。

在祖国医学中，肾虚衰老一直占主导地位，采用补肾填精的方法可以在机体水平延缓衰老，并在实验上得到证实。盖因“人始生，先成精，精成而脑髓生”（《素问・经脉篇》），脑依赖于脑髓而“以统全身”，肾藏精，“肾不生则髓不满”、“肾虚则智不足，善忘其前言”（《医学心悟》）。从肾论治脑病，尤其是衰老相关脑病也已经得到一定的认可。熟地黄入肾滋阴，是传统的延年益寿、抗衰老的中药，具有良好的充髓、养髓作用，《本经》、《本草蒙筌》、《本草纲目》均谓其“填骨髓”。现代药理学研究发现，熟地黄具有抗衰老、益智、提高机体免疫力的作用［4-6］

基于祖国医学的传统理论，作者从上世纪90年代起在总结国医大师张学文教授学术经验基础上，提出了老年性痴呆等衰老相关中医脑病补肾生髓，佐以活血化痰，醒脑开窍的治则治法，在此基础上组方并临症加减确立了地黄益智方，全方由熟地、龟板胶等组成。我们前期研究显示，该复方能够明显改善东莨菪碱所致老年性痴呆模型大鼠行为学表现，改善脑生化、神经递质变化、延缓海马神经细胞衰变过程。证实该复方小、中、大剂量组均能够改善D-半乳糖衰老模型大鼠行为学、提高衰老模型大鼠脑组织抗氧化能力，对海马CA1区细胞周期相关P53、P21和CDKN2A阳性蛋白的表达，该复方有一定的抑制作用，并能下调对应基因P53、P21在转录水平的表达，研究结果在一定程度上从细胞周期的角度为补肾填精生髓延缓衰老提供了依据［7-8］。本实验显示地黄益智方可抑制衰老大鼠脑组织细胞衰老，提示地黄益智方可能有延缓脑衰老的作用。

参考文献

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