对流动分析烟草中纤维素酶解
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纤维素是烟草中主要的细胞壁物质,其含量高低直接影响烟叶的品质。低等级烟叶由于纤维素含量较高,其烟气会产生强烈的刺激性、呛咳、涩口、枯焦气[1],因此,测定烟草中的纤维素,对于评价烟叶品质具有重要意义。传统的测定方法主要采用稀酸、稀碱与样品依次共煮后用有机溶剂处理,再经烘干后称重[2-4],这种方法操作繁琐,费力耗时,且由于操作人员的技术差异会带来很大的误差。近年来,近红外(NIR)光谱分析技术也被用于烟草中纤维素含量的测定[5],但是因其数据模型的建立需要大量的数据支撑,其应用受到一定的局限。根据纤维素水解后生成葡萄糖的性质,采用酶解纤维素得到葡萄糖[6-7],然后利用流动分析仪检测还原糖含量[8],可计算得到纤维素的含量,而且酶水解具有专一性和高效性[9-10],流动分析仪在行业内的应用也比较广泛,因此,建立测定烟草中纤维素含量的流动分析法,可为评价烟叶的品质提供技术支持。
1材料与方法
1.1材料、试剂与仪器2009年初烤烟叶样品17个(川渝中烟工业公司提供)。冰醋酸、柠檬酸、柠檬酸三钠(AR,重庆川东化工有限公司化学试剂厂);葡萄糖、氯化钙、氢氧化钠(AR,重庆北碚化学试剂厂);纤维素酶(BR,活力>15000DU,国药集团化学试剂有限公司);聚乙氧基月桂醚、对羟基苯甲酸酰肼(AR,荷兰Skalar公司)。SkalarSan++流动分析仪(荷兰Skalar公司);AX504分析天平(感量:0.0001g,瑞士MettlerToledo公司);恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂);循环水真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);G3玻璃砂心漏斗(长春市玻璃仪器厂)。
1.2样品处理和分析准确称取0.25g40目烟粉,置于100mL锥形瓶中,加入25mL5%醋酸溶液,摇床振荡萃取30min,萃取出样品本身含有的水溶性糖[8],用G3漏斗过滤,滤渣用蒸馏水冲洗3次,每次50mL;将滤渣转移到100mL锥形瓶中,加入60mL含有0.25g纤维素酶的柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液(pH4.7)[7,11],然后放入37℃恒温摇床水解24h;水解结束后将样品冷却至室温,过滤,用蒸馏水将滤液定容至100mL,利用流动分析仪测定样品液中的葡萄糖,测得葡萄糖含量乘以转换系数0.9(由纤维素水解方程式计算得到)即得纤维素含量。
2结果与讨论
2.1酶解条件的选择
2.1.1缓冲溶液用量对纤维素水解的影响准确称取0.25g烟粉样品5份,按照1.2的方法除水溶性糖,然后分别加入固定纤维素酶量(0.25g纤维素酶)的缓冲溶液40,50,60,70,80mL,在固定温度(37℃)条件下水解24h,纤维素含量的测定结果如图1所示。由图1可知,随着缓冲液体积的增大,纤维素测定量也逐渐升高,当缓冲溶液用量为60mL时,达到最高值,说明此时纤维素水解完全;当缓冲溶液用量大于60mL后,纤维素测定量逐渐降低,这可能是由于缓冲溶液用量过大,导致了酶浓度降低,酶不能与底物充分接触,从而使酶解效果变差。因此,选择缓冲液用量为60mL。
2.1.2酶用量对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL、其他条件不变的情况下,分别考察酶用量为0.05,0.10,0.15,0.20和0.25g时的酶解效果,结果如图2所示。由图2可知,当酶用量为0.20g时,纤维素测定量最高,考虑到生物酶较容易部分失活,为保证纤维素水解完全,所以确定酶用量为0.25g。
2.1.3温度对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL和酶用量为0.25g的情况下,分别考察纤维素在30,35,40,45和50℃下的水解效果,结果如图3所示。由图3可知,当温度40℃时,纤维素测定量降低,这可能是因为温度过高导致酶失活,使纤维素水解不完全;较适宜的水解温度为35~40℃,实验选择37℃。
2.1.4时间对纤维素水解的影响在缓冲液用量为60mL、酶用量为0.25g和水解温度为37℃的情况下,分别水解20,22,24,26和28h,结果(图4)表明,24h后,纤维素水解完全,所以确定水解时间为24h。
2.2工作曲线与检测限准确称取2.2009g葡萄糖,用蒸馏水溶解并定容至100mL,摇匀,得标准储备液。移取1,2,3,4,5mL标准储备液,分别用蒸馏水稀释并定容至100mL,摇匀,即得葡萄糖系列标准溶液,浓度分别为0.2,0.4,0.6,0.8和1.0mg/mL,相当于纤维素0.18,0.36,0.54,0.72,0.90mg/mL。用流动分析仪测定标准溶液中的葡萄糖含量,并对电信号响应值Y(峰高,DU),与其浓度X(纤维素含量,mg/mL)进行线性回归分析,得其工作曲线回归方程为:Y=15893.3X+2117.5,r=0.9998。可以看出,纤维素在0.18~0.90mg/mL浓度范围内,工作曲线线性良好,适合于定量分析。通过测定空白试样,测得纤维素的检测限[12]为0.11mg/mL。
2.3精密度和回收率采用本方法对烟草样品的纤维素分别测定6次,测定量分别为125.8,120.7,126.9,127.3,126.2和125.1mg/g,相对标准偏差(RSD)为2.40%,说明本方法的重复性较好。在脱糖烟草样品中加入葡萄糖,测定其回收率,结果如表1所示。纤维素的回收率为96.7%~103.8%,说明本方法的准确性较高。
2.4与经典方法[3]比较分别用本方法和经典方法测定16个烟草样品的纤维素含量,结果如表2所示。通过对两组数据进行配对样品t检验,发现二者无显着性差异,说明该方法适合于烟草中纤维素含量的检测。
3结论
确定了流动分析法测定烟草中纤维素水解条件为:缓冲溶液60mL,纤维素酶0.25g,水解温度37℃,水解时间24h;与经典方法相比,该方法具有重复性好、回收率高、操作简便等优点,适合于批量烟草样品中纤维素含量的快速分析。