甜瓜种质资源多样性的SSR分析
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摘要：采用EST-SSR标记对59份甜瓜（Cucumis melo L.）种质资源的遗传多样性进行研究。结果表明，46对EST-SSR标记中有23对扩增出多态性，EST-SSR标记的多态性信息含量（Polymorphic information content，PIC）值的分布范围为0.239～0.588，平均值为0.386；46个标记共检测到54个多态性位点，种质两两之间的简单匹配（Simple matching，SM）系数范围为0～0.981；聚类结果表明，在相似系数为0.19处，59份甜瓜种质可以分为2类。
关键词：甜瓜（Cucumis melo L.）；EST-SSR；遗传多样性；PIC；SM
中图分类号：S652；Q7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3106-05
SSR Analysis of Genetic Diversity of the Germplasm Resource of Cucumis melo L.
TANG Mi，ZHAO Hong-fei，CHENG Wei-shun，REN Jian，SUN Yu-hong，ZHOU Mo-bing
（Wuhan Academy of Agricultural Science，Wuhan 430345，China）
Abstract： The genetic diversity of 59 melon（Cucumis melo L.） germplasm resources were studied using EST-SSR markers. The results showed that 23 pairs of 46 pairs EST-SSR markers were polymorphic. The polymorphic information content （PIC） values of these markers varied from 0.239 to 0.588， with the average of 0.386. 54 polymorphic sites were detected from 46 pairs of EST-SSR markers， and the simple matching（SM） coefficients of 0～0.981. The results of cluster showed that 59 melon germplasm resources could be devided into two groups when the SM coefficient was 0.19.
Key words： melon（Cucumis melo L.）； EST-SSR； genetic diversity； PIC；SM
甜瓜（Cucumis melo L.）是重要的经济作物之一，在国内外广泛栽培。我国是甜瓜生产大国，甜瓜收获面积和产量分别占全球总面积的37.0%和总产量的47.9%[1]，甜瓜产业具有较强国际竞争力和经济增长空间。2009年启动的国家西甜瓜产业技术体系，将甜瓜产业发展推向更广阔的平台。种质资源是育种和有关生物学研究的基础，因此发展甜瓜产业的关键在于有效、合理地利用种质资源，对其进行全面的研究和鉴定，并做出科学评价。甜瓜育种实践表明，用于杂交的两个亲本品种（材料），其综合性状水平应最大限度的保持互补性，但血缘关系要尽可能的远，这样才能选育出具有突破性的新品种。目前在新品种选育过程中，有集中利用少数亲本的倾向，导致育成品种亲缘关系较近，遗传基础狭窄。因此，明确育种材料的遗传多样性和血缘组成已成为甜瓜育种的重要基础工作。
利用分子标记研究甜瓜遗传多样性已有报道，所用标记涉及RAPD[2]、ssr[3，4]、AFLP[5，6]、SRAP[7]等，随着测序技术的不断提高和分子生物学研究的深入，大量瓜类作物的EST 被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计划研究小组共收录有关甜瓜的EST 129 067条[8]。基于EST（Expressed sequence tag）库开发的SSR（Simple sequence repeat）标记称为EST-SSR。相对于基因组SSR，EST-SSR充分利用现有的测序数据，省去了SSR引物开发过程中的文库构建和测序等步骤，降低了成本。另外，EST-SSR来源于基因编码区，可能与功能基因的表达具有直接的联系，其保守程度更高，在不同物种间有一定的通用性，其多态性也反映了功能的多样性。因此，EST-SSR标记特别适用于种质系统发生关系的研究和种质资源的遗传多样性评价[9-11]。
多态性信息含量PIC（Polymorphic information content）是度量标记多态性检测能力的工具，PIC综合考虑了等位基因的数量和频率，能有效地度量DNA标记检测的信息度，已被广泛地应用于分子标记多态性检测能力的评价[9，12]。
本研究采用EST-SSR标记来分析甜瓜种质资源的遗传多样性，明确甜瓜种质的遗传关系，为其分类提供依据，以期指导育种中合理选择选配亲本，从而减少育种的盲目性，加快遗传改良进程。
1 材料与方法
1.1 材料
选用59份甜瓜材料用于多态性的分析，其中28份为武汉市农业科学研究所西甜瓜资源与育种研究室收集后经过3～5代自交提纯留种，4份由中国农业科学院蔬菜花卉研究所王怀松研究员提供，4份由新疆农业科学院哈密瓜研究中心伊鸿平研究员提供，8份由华中农业大学别之龙教授提供，5份由新疆邓建新老师提供，10份来源于2012年全国西甜瓜区域试验和生产试验光皮组甜瓜品种。试验材料的名称及编号见表1。
1.2 方法
1.2.1 甜瓜基因组DNA提取和浓度测定 将供试材料播种于温室中，待甜瓜长出3～4片真叶时，随机选取3株，每株取一片较大的真叶，置于研钵中研磨，采用改良的CTAB法[13]提取甜瓜基因组DNA，经琼脂糖电泳及紫外分光光度法检测DNA的浓度与纯度，稀释为30 ng/μL，-20 ℃保存。
1.2.2 EST-SSR引物信息 从前人研究结果[9，14]中初步选取46对引物来进行EST-SSR引物的筛选，其中有23对引物具有多态性，引物信息如表2所示。
1.2.3 SSR分析 PCR反应的总体系为10 μL，含有1×Buffer 1 μL，2 mmol/L MgCl2 1 μL，200 μmol/L dNTPs 1 μL，0.2 μmol/L 上、下游引物各1 μL，0.5 U Taq酶 0.2 μL，20 ng DNA 0.5 μL，ddH2O补至10 μL。Taq酶和引物均购自上海生工生物有限公司。PCR扩增程序参考孔秋生[15]的方法，扩增产物采用8%非变性PAGE凝胶进行检测。
1.2.4 数据分析
1）多态性信息含量：根据以下公式计算PIC值。
式中，k是一个SSR所检测到的等位基因的数量，Pi是第i个等位基因的频率。
2）聚类分析：将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现的条带记为“0”，生成由“1”和“0”组成的原始矩阵，采用NTSYS-pc 2.10e软件进行数据分析。对原始矩阵用SimQual程序求SM相似系数，并获得相似系数矩阵。采用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图。
3）主坐标分析：采用NTSYS-pc 2.10e软件对EST-SSR标记获得的原始0、1矩阵进行主坐标分析。对原始矩阵求得的相似系数矩阵，采用DCENTER程序对系数矩阵进行转换，再用EIGEN程序求出特征值和特征向量，并做主坐标之间的二维图和三维图。
2 结果与分析
2.1 EST-SSR标记的PIC值
46对EST-SSR标记中有23对扩增出清晰条带，其中引物CM38的扩增图谱如图1所示。在这23对引物中，引物CM33检测到的PIC值最小，为0.239；引物CM38检测到的PIC值最大为0.588，在59个甜瓜基因型中，23个EST-SSR标记检测到的PIC值的分布范围为0.239～0.588，平均PIC值为0.387（表3）。
2.2 甜瓜种质的聚类分析
对59份甜瓜种质进行检测，共检测到54个多态性位点。对结果进行统计，生成0、1矩阵，计算种质之间的简单匹配系数（SM），利用UPGMA法进行聚类分析。59份甜瓜种质两两之间的SM系数范围为0～0.981。其中风味5号和A23之间、雪里红和A23之间的相似系数均为0，表明风味5号和雪里红这2份种质与A23之间的遗传差异最大。风味5号和雪里红是厚皮甜瓜，而A23是薄皮甜瓜，两者之间的相似系数最低也反映了厚皮甜瓜和薄皮甜瓜种质之间存在的遗传差异。IVF55和来凤之间、翠玉和来凤之间的相似系数均为0.981，表明IVF55和翠玉这2份种质与来凤之间的遗传差异最小，这3份种质均为薄皮甜瓜。
采用UPGMA算法进行聚类分析，得到这59份甜瓜种质资源聚类图（图2）。从图2可以看出，在相似系数为0.19处，59份甜瓜种质可以分为两类：第一类是包括Ba-2在内的薄皮甜瓜种质和大部分厚皮甜瓜种质；第二类仅包括薄皮甜瓜A23和厚皮甜瓜A41共2份种质。
在相似系数为0.58处，这两类甜瓜种质又可以进一步细分。第一类可以细分为3个组：第一组包括Ba-2、A3等9份种质；第二组仅包括1份种质GQ-219；第三组包括网络时代2号和A44在内的47份种质。其中第一组均为薄皮甜瓜，而第三组种质基本上没有共同的表型特征。由于所用的甜瓜种质材料大部分是提供的商品种，品种选育过程中种质之间的遗传交流等因素可能是造成品种分类混杂的主要原因。
2.3 甜瓜种质的主坐标分析
对46个EST-SSR标记在59份甜瓜种质上扩增的结果进行主坐标分析，前三个主坐标能解释全部变异的40.85%，其中第一主坐标所解释的变异占25.81%，第二主坐标和第三主坐标所能解释的变异分别占7.82%和7.22%。对前两个主坐标和前3个主坐标分别做59份种质的二维图和三维图，结果见图3和图4。
从二维图上（图3）可以看出，EST-SSR能清楚地区分厚皮甜瓜和薄皮甜瓜。在图中左部分分布的是厚皮甜瓜，本试验选取的大部分甜瓜种质材料为厚皮甜瓜。右部分分布的是薄皮甜瓜种质，包括Ba-2、Bc-2、IVF55、B9、翠玉、香甜王子、来凤地方甜瓜7份，这些种质在二维图上聚集在一起。
为进一步细分种质，继续做分辨率更高的前3个主坐标的三维图。从三维图上（图4）可以看出，厚皮甜瓜和薄皮甜瓜之间，以及厚皮甜瓜之间的差异更加明显，但7份薄皮甜瓜种质在图上仍然呈连续分布。
从46个EST-SSR标记对59份甜瓜种质系统发生关系的分析结果可以看出，EST-SSR能够有效区分厚皮甜瓜和薄皮甜瓜之间的遗传差异，且检测出的厚皮甜瓜遗传变异呈连续分布，没有表现出明显的特征。
从获取的EST-SSR数据来源中可见，本研究选用的部分标记可能存在如表4所列的功能。通过同源性搜索获得的这些功能，实际上也反映了本试验选用的甜瓜种质中存在这些基因的功能多样性。
3 结论与讨论
在鉴定甜瓜品种资源亲缘关系上，SSR能够弥补单独依靠表型鉴别亲缘关系的不足，本研究利用SSR分子标记将59份材料分类聚成薄皮和厚皮两大类型，厚皮类型还可细分为果皮带网纹或光皮、果皮黄色或白色等类别，但聚类分析结果没能将果肉颜色、肉质是否松脆、果型等形态学上的差异区分开，同一类型中各品种间的遗传相似系数比较大，说明遗传背景狭窄，差异不大，这与试验材料的覆盖面不够广有一定关系。
PIC值的分布范围为0～1，PIC值越大表明标记检测多态性的能力越强。在本研究中，甜瓜EST-SSR标记的PIC值分布范围为0.239～0.588。由于试验使用的甜瓜材料大多是厚皮甜瓜品种，只是甜瓜遗传变异中的很小一部分，如扩大试验材料的来源，甜瓜EST-SSR所检测的PIC值可能要高一些。另外，本研究中甜瓜EST-SSR的平均PIC值要低于其他研究中报道的来自基因组标记的PIC值[9]，这是由于EST-SSR来自于序列保守的转录区，其变异的丰富度不及基因组非转录区的缘故。
利用SSR标记进行遗传多样性分析需要有足够的SSR引物，理想的状况是根据基因组来设计覆盖范围广的引物。如何开发更加经济有效的共显性固定标记是分子研究迫切的要求。目前，葫芦科中甜瓜、西瓜和黄瓜的基因组测序均已完成，这将极大的推动葫芦科瓜类作物基因组学的研究，促进发掘新的EST-SSR，避免简单的重复性工作，深化EST-SSR的研究。
致谢：本试验得到新疆农业科学院哈密瓜研究中心伊鸿平研究员和华中农业大学园艺林学学院孔秋生副教授在资源搜集方面的支持及试验方面的悉心指导，在此一并表示衷心感谢。
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