HPLC法测定阿维拉霉素预混剂中阿维拉霉素的含量

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摘 要：目的：采用hplc法测定10%阿维拉霉素预混剂中阿维拉霉素的含量。方法：测定色谱条件为：流动相：乙腈-0.2%（g/mL）磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值至3.0）（51∶49）；色谱柱：菲罗门C18（5μm，4.6mm×250mm）；检测波长：214nm。结论：阿维拉霉素在0.1～5mg/mL范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9998；阿维拉霉素的回收率为98.7%～101.0%；阿维拉霉素的测定重复性RSD为0.97。结论：该方法具有分析时间短、线性范围宽、定性结果精确和重现性好、样品前处理简便等特点，为阿维拉霉素预混剂的质量控制提供了依据。

关键词：10%阿维拉霉素预混剂；HPLC；含量测定

中图分类号 S948 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）12-0157-003

Abstract：Objective：High performance liquid chromatographic method was used for the determination of the content of Avilamycin in 10% Avilamycin Premixt. Method：Determination of chromatographic conditions：mobile phase：acetonitrile：0.2%（g/ml）ammonium dihydrogen phosphate solution（51：49 v/v）with pH value at 3.0（adjusted by phosphate），column as C18（5μm，4.6mm×250mm），detection wavelength of 214nm.Conclution：0.1～5mg/mL Avilamycin has good linearity，the correlation coefficient R2 is 0.9998；the recovery rate of avilamycin is 98.7%～101.0%；the detection repeatability RSD of avilamycin is 0.97. Conclution：With features of short testing time，wide linearity，precise assay result，good repeatability，easy pre-treatment of samples and so on，such HPLC assay method provides good basis for avilamycin premix quality control.

Key words：10% avilamycin premix；HPLC；Determination of content

阿S拉霉素预混剂（Avilamycin）是作为饲料添加剂中的一种抗生素，属于混合型的低聚糖[1]。阿维拉霉素预混剂是由阿维拉霉素与大豆粉和防尘油配制而成，阿维拉霉素又称为卑霉素、阿美拉霉素、阿维霉素、肥拉霉素，是一种新型消化促进剂和代谢调节剂[2]，是由产绿色链霉素菌Streptomyces viridoehrongenes发酵而生成的二氯异扁枝衣酸酯，属于正糖霉素族的寡糖类抗生素[3]。阿维拉霉素预混剂对革兰氏阳性菌、产气梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄杆菌、链球菌（乳酸菌除外）以及部份革兰氏阴性菌十分敏感，可以有效防治仔猪腹泻，具有促生长作用，是一种新型的促生长素类饲料添加剂。

阿维拉霉素预混剂因阿维拉霉素结构独特，具有安全性高、不易被肠道吸收、基本无残留、毒性小、不存在交叉耐药性、易分解等特点，因实际效果稳定而获得了较高的评价。由于阿维霉素无药残现象，其在畜禽饲料中添加使用时，无需停药期。目前，世界上主要的养殖业国家或地区如欧盟、日本、巴西，效美素被广泛地添加于鸡、猪饲料中，以提高畜禽的生产绩效和抗病能力。我国农业部于2005年批准进口使用进口兽药再注册目录，批准号为（2005）外兽药证字56号。

目前，国内外报道的阿维拉霉素的检测方法有微生物效价测定方法、气相色谱法-质谱联用检测法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、放射性同位素标记法和高效液相色谱-质谱联用检测法（HPLC-MS），但我国目前尚未建立阿维拉霉素预混剂的标准检测方法[4]。因此，为了加强对阿维拉霉素预混剂的监控，建立和规范其检测方法，并制定相应的行业标准已迫在眉睫，本文按照中华人民共和国农业部公告第2060号要求，根据阿维拉霉素的结构特点，建立了测定阿维拉霉素预混剂中阿维拉霉素含量的HPLC法，为阿维拉霉素预混剂的质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与化学试剂 日本岛津SPD-20A反相液相色谱仪；柱温箱CTO-20AC；1/100000天平METTLER MS105DU；超纯水仪UPR-5T；超声波清洗器KQ-500DE；10%阿维拉霉素预混剂来源：效美素，美国礼来公司英国DISTA生产厂；阿维拉霉素对照品来源：礼来公司，含量A为86.93%，B为11.00%；水为超纯水；乙腈为色谱纯。

1.2 色谱条件 流动相：乙腈-0.2%（g/ml）磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值至3.0）（51∶49）；色谱柱：菲罗门C18（5μm，4.6mm×250mm）；检测波长：214nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

1.3 对照品溶液的配制 （1）精密称取在60℃真空干燥3h的对照品40mg（实际称样量40.45mg，对照品含量97.93%），至100mL容量瓶中，加水2mL，静置5min使对照品湿润，加丙酮20mL，超声15min，冷却后，用乙腈-0.132%（g/ml）磷酸氢二铵溶液（用磷酸调节pH值至7.0）（50∶50）稀释至刻度，制成约0.4mg/mL的对照品溶液。

1.4 样品溶液的配制 精密称取500mg试样到50mL容量瓶中，加水2mL，静置5min使对照品湿润，加丙酮20mL，超声15min，冷却后，用丙酮稀释至刻度，过滤，精密量取10mL至25mL容量瓶中，乙腈-0.132%（g/mL）磷酸氢二铵溶液（用磷酸调节pH值至7.0）（50∶50）定容，制成约0.4mg/mL的样品溶液。

1.5 系统适用性试验 取上述1mg/mL的对照品20μL分别按1.2色谱条件下进样，测定并计算柱效、分离度和拖尾因子（见表1）。

1.6 线性试验 取上述对照品储备液分别稀释成5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的系列对照品溶液，按1.2色谱条件测定，以峰面积A对浓度进行回归，阿维拉霉素峰面积A的回归方程分别为：Y=107x+98580（R2 =0.9998），说明阿维拉霉素在0.1～5mg/mL范围内具有良好的线性关系（图1）。

1.7 重复性试验 精密吸取同一批供试品溶液，按1.2项色谱条件测定，进样5次，得阿维拉霉素含量的RSD为0.97，表明样品重复性良好（表2）。

1.8 回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品（含量为98.010mg/g）约500mg（共9份）置于100mL容量瓶中，分别加入对照品30mg、50mg和70mg，按上述1.4项要求处理，进样测定。样品阿维拉霉素的回收率为99.43%（表3）。

1.9 检测限 在上述色谱条件下，测定最低检测限为2ng。

1.10 供试品测定 取3批样品及标准溶液，按外标法测定，每批样品进样2次，计算样品样品中阿维拉霉素含量（图2）。3批样品的含量测定结果分别为97.47μg/mL、98.01μg/mL、97.68μg/mL。

2 Y论

本试验建立了HPLC法测定10%阿维拉霉素预混剂中阿维拉霉素含量的方法，测定色谱条件为：流动相为乙腈-0.2%（g/ml）磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值至3.0）（51∶49），色谱柱为菲罗门C18（5μm，4.6mm×250mm），检测波长为214nm，流速为1.0mL/min，在0.1～5mg/mL范围内具有良好的线性关系。该方法具备分析时间短、线性范围宽、定性结果精确和重现性好、样品前处理简便等特点，为阿维拉霉素预混剂的质量控制提供了依据。

参考文献

[1]Irina Treede，Lene Jakobsen，Finn Kirpekar，et al.The avermectins resistance determinants AviRa and AviRb methylate 23S rRNA at the guanosine 2535 base and ridine 2479 ribose[J].Molecular Microbioligy，2003，49（2）：309-318.

[2]陈永辉，刘波，曾兆国，等.阿维拉霉素研究进展[J].饲料工业，2007，28（14）：9-11.

[3]任健，童应凯，吴兆亮.卑霉素的合成途径及分子生物学进展[J].天津农学院学报，2008，15（3）：47-51.

[4]魏德宝，鲍恩东.饲料中阿维拉霉素含量反相HPLC检测方法的建立[J].南京农业大学学报，2010，33（3）：99-103.

（责编：张宏民）