HPLC测定不同产地北豆根中蝙蝠葛碱含量

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摘要：目的 建立不同产地北豆根中蝙蝠葛碱含量测定的hplc方法。方法 以C18为色谱柱填充剂，以乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1）为流动相，检测波长为284 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，建立8批不同来源的北豆根HPLC图。结果 建立了检测北豆根的HPLC条件，在20～100 ?g/mL范围内，对照品进样量与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 5），蝙蝠葛碱的平均回收率为100.30%，RSD=1.000%。不同来源的北豆根中蝙蝠葛碱含量不同。结论 本研究建立的HPLC方法灵敏，准确度、精密度、重复性好，操作简便，可作为北豆根中蝙蝠葛碱含量的检测方法。

关键词：北豆根；蝙蝠葛碱；含量测定；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.017

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）06-0068-03

Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the contents of dauricine in Menispermi Rhizoma from different producing areas. Methods C18 was set as chromatographic column filler， with acetonitrile- water-triethylamine （45：55：0.1） as the mobile phase， 284 nm as the ultraviolet wavelength detection， 1 mL/min as the flow rate， 30 ℃ as the column temperature. HPLC chromatograms of eight different batches of Menispermi Rhizoma were established. Results HPLC testing conditions of Menispermi Rhizoma was established. Within 20C100 ?g/mL， there was a good linear relationship between the injection volume of the reference substance and the peak area （r=0.999 5）. The average recovery of dauricine was 100.30%， RSD=1.000%. The contents of dauricine in Menispermi Rhizoma from different producing areas were different. Conclusion The HPLC method is with sensitivity， accuracy， precision， good reproducibility and simple operation， which can be used as detection method to determine the content of dauricine in Menispermi Rhizoma.

Key words： Rhizoma Menispermi； dauricine； content determination； HPLC

北豆根为防己科植物蝙幅葛Menispermum dauricum DC.的干燥根茎，具有清热解毒、祛风止痛功效，用于治疗咽喉肿痛、热毒泻痢、风湿痹痛[1]。北豆根的主要活性成分为生物碱，其总生物碱含量为1.7%～2.5%，主要为蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛诺林碱、蝙蝠葛新诺林碱、蝙蝠葛可林碱、蝙蝠葛新可林碱、去甲基蝙蝠葛碱、蝙蝠葛新林碱、粉防己

碱[2]，但不同产地的北豆根生物碱种类及含量有一定区别。本研究检测不同产地的北豆根中蝙蝠葛碱的含量，鉴定不同来源北豆根的优劣，为其资源开发和利用提供依据。

1 仪器与试药

LC-10AT型液相色谱仪、SPD-10A型紫外检测器，日本岛津公司；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），广州菲罗门科学仪器有限公司；100 μL微量进样器，上海高鸽工贸有限公司；SB5200D型超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；ACCULAB型万分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；24目标准检验筛，浙江上虞市华丰五金仪器有限公司；DFY-200型摇摆式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司。

蝙蝠葛碱对照品（批号11867-201303），广州市药品检验所；甲醇为色谱纯，乙腈、三乙胺为分析纯，水为纯净水。北豆根样品采自不同产地，经暨南大学蔡宇教授鉴定为防己科植物蝙幅葛Menispermum dauricum DC.的干燥根茎，来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流酉辔乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1），检测波长284 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 ?L[3-4]。分离度>3，理论塔板数按蝙蝠葛碱计不低于5000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取经P2O5干燥至恒重的蝙蝠葛碱对照品5.0 mg，纯乙腈溶解，定容至10 mL容量瓶中，精密量取2 mL，置于10 mL容量瓶中，用纯乙腈定容，得100 ?g/mL的贮存液，分别量取2、4、6、8 mL贮存液，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得20、40、60、80 ?g/mL的蝙蝠葛碱对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

北豆根样品粉碎、过24目标准检验筛，取过筛粉末约0.200 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，静置30 min，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足p失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，摇匀，微孔滤膜（0.45 ?m）过滤，取续滤液，即得。

2.4 系统适用性试验

在“2.1”项色谱条件下，对照品与供试品色谱分离效果良好，北豆根样品中其他成分不干扰蝙蝠葛碱的含量测定，方法具有较高的专属性，蝙蝠葛碱的保留时间为10.349 min。色谱图见图1。

2.5 线性关系考察

吸取“2.2”项下不同浓度的对照溶液各20 ?L，按“2.1”项下色谱条件分别测定，以峰面积对对照品溶液浓度进行回归计算，得回归方程Y=17 906X-113 056，r=0.999 5，结果表明蝙蝠葛碱在20～100 ?g范围内与峰面积线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取同一浓度蝙蝠葛碱对照品溶液20 ?L，连续进样5次，记录各色谱峰面积，结果RSD=1.977%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

称取同一批次的北豆根样品约0.200 0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 ?L，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录蝙蝠葛碱峰面积，结果RSD=1.849%，表明供试品溶液中蝙蝠葛碱在24 h内稳定。

2.8 重复性试验

称取同一批次的北豆根样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录蝙蝠葛碱峰面积，结果RSD=1.240%，表明本方法重复性较好。

2.9 加样回收率试验

取同一批次已知含量的北豆根样品6份，每份约0.100 0 g，精密称定后分别加入等量的蝙蝠葛碱对照品，按“2.3”项下方法制备加样供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样测定，结果平均加样回收率为100.30%，RSD=1.000%，结果见表2。

2.10 样品含量测定

取不同产地的北豆根样品各约0.200 0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算蝙蝠葛碱含量，结果见表3。

3 讨论

本试验对提取方法进行了考察：①氯仿30 mL及浓氨水1 mL，浸泡过夜，再加氯仿50 mL，索氏提取3 h[4]；②甲醇20 mL，超声30 min[5]；③甲醇25 mL，超声30 min[1]。结果显示，①和③含量较高且比较接近，但方法③简便，而且节省能耗和试剂，所以选择甲醇25 mL超声30 min作为样品的提取方式。

试验对北豆根的流动相进行筛选，使用不同比例磷酸水与乙腈[6-7]，但蝙蝠葛碱的保留时间与其溶剂的保留时间有重叠，2个峰无法分开，所以使用含有三乙胺和乙腈的流动相，结果流动相为乙腈-0.05%三乙胺溶液（45∶55），得到的谱图良好，但保留时间在32 min左右，时间稍长，最后综合保留时间和谱图形状，选择流动相为乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1）[8]，该流动相得到的谱图形状对称，峰形良好，保留时间适合。但是采用乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1）为流动相，其pH值较高，达到9，所以需选用耐碱性高的色谱柱。

本研究对不同产地的北豆根进行液相分析，在选择的提取方式和液相条件下，不同来源的样品中蝙蝠葛碱的含量不同，其中以来源于黑龙江苇河的北豆根中含量最高，其次是黑龙江鹤岗，其他产地北豆根中蝙蝠葛碱的含量相对较低，所以，在应用不同产地北豆根时应当注意其质量的差异。

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（收稿日期：2016-12-26）

（修回日期：2017-01-13；编辑：陈静）