免疫性血小板减少症患者协同刺激分子的表达及意义

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【摘要】 目的：探讨特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者外周血淋巴细胞CD28、CD80及CD86的表达及意义。方法：采用免疫荧光标记和流式细胞术检测30例ITP患者和30例健康对照者外周血CD28细胞、CD80细胞和CD86细胞分别占淋巴细胞的比例及血小板表面相关抗体水平，并进行对比、分析。结果：与正常对照组相比，ITP患者外周血CD28细胞增多，差异有统计学意义（P0.05）；CD86细胞显著增多，差异有统计学意义（P0.05）。患者与正常对照组PAIgA、PAIgG和PAIgM的水平比较差异有统计学意义（P

【关键词】 免疫性血小板减少症； CD28； CD80； CD86

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一类以血小板数量减少为主要特点的出血性疾病，其表现为血小板寿命缩短，骨髓象见骨髓巨核细胞数目增多，一般脾脏无明显肿大[1]。目前的研究表明，该类疾病患者存在免疫反应异常，导致其体内产生血小板抗体（PAIg），引起血小板被巨噬细胞破坏增加。而有研究显示，T、B淋巴细胞的免疫异常与ITP的发病密切相关，包括其活化、增殖、凋亡异常等方面，而在这一过程中协同刺激分子（CD28、CD80、CD86）的作用显得尤为重要[2-3]。为了探讨ITP发病的免疫相关机制，笔者采用免疫荧光标记及流式细胞技术检测ITP患者外周血淋巴细胞中CD28、CD80、CD86的表达，并检测ITP患者血小板抗体（PAIgA、PAIgG和PAIgM）水平，分析其与协同刺激分子表达改变的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月-2014年6月间本院门诊及住院的ITP患者30例，诊断均符合第3版《血液病诊断及疗效标准》[1]。选择30例近期无感染、肝炎、结核的健康志愿者作为正常对照组，ITP组年龄18～75岁，中位年龄46岁，其中男16例，女14例，急性18例，慢性18例，采集标本时血小板数为（2～45）×109/L，未行脾切除治疗。正常对照组年龄18～70岁，中位年龄42岁，其中男15例，女15例，采集标本时血小板为正常，所有研究对象采血时均未接受血小板输注。

1.2 材料及试剂 FACSCalibur型流式细胞仪为BD公司产品。单克隆抗体CD4-APC，CD28-PE，CD80-FITC，CD86-PE，CD19-APC及其阴性对照均购于美国BD Pharmingen公司。

1.3 方法

1.3.1 CD28、CD80、CD86的检测 （1）标本采集：采集受检者空腹静脉血2 mL， EDTA-K2抗凝。（2）单克隆抗体标记：分别取100 μL抗凝血放入3支验管和1支对照管，实验管分别加20 mL CD28-PE、CD80-PE、CD86-PE，对照管加20 mL鼠抗人IgG1-PE，室温避光孵育30 min，加入细胞裂解液2 mL混匀，静置8 min，300 g离心5 min。（3）弃上清，加入PBS缓冲液，混匀200 g离心5 min。（4）弃上清，每管加入250 mL鞘液，重悬细胞，上流式细胞仪检测。（5）协同刺激分子的检测：用前向角散射和侧向角散射散点图区分细胞群体，用门圈出分析的淋巴细胞群体。每份标本检测20 000个细胞。计算CD28、CD80及CD86阳性细胞比例。

1.3.2 血小板相关抗体（PAIg）检测 采用酶联免疫法测定PAIg，抽取受检者静脉血4 mL，EADT-Na2抗凝，分离血小板，按ELISA法试剂盒操作说明书进行PAIg检测。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P

2 结果

3 讨论

有研究显示，在ITP患者体内可检测到血小板的自身抗体，这些抗体能够与血小板的表面抗原结合，与巨噬细胞Fc受体相互作用，进而导致巨噬细胞对血小板的清除，引起血小板的减少[4]。目前已有试验证实，T淋巴细胞在ITP患者体内的异常活化，导致了自身抗血小板抗体的产生，从而引起ITP发病[5]。

在T细胞的活化过程中，需要两个信号进行刺激，一个是来自抗原递呈细胞（APC）表面的MHC-Ag复合体，其通过T细胞上的TCR/CD3传递给T细胞的初始激活信号。另一个则是协同刺激信号，该类协同刺激因子是由APC和T细胞表面的黏附分子相互作用所提供的。目前研究所发现的最重要的协同刺激因子是CD80、CD86与CD28，CD80、CD86作为受体，广泛存在于抗原递呈细胞（APC）上，如B淋巴细胞、单核巨噬细胞，而CD28则是T淋巴细胞上的相应配体[6]。CD28属于免疫球蛋白超家族成员，其定位于染色体2q33区[7-8]。它主要表达于T细胞和浆细胞表面。通过CD28/B7分子对T细胞的协同刺激作用可增强IL-2基因转录，促进IL-2合成[9]。另外，CD28分子所启动的胞内信号还可促进Bcl-XL表达从而保护T细胞免于凋亡[10]。赵艳霞等[11]发现，ITP患者外周血CD4+CD28+细胞表达下调，从而使T细胞易被诱导凋亡因素激活而凋亡。

根据McMillan R等[12]的研究报道，ITP发病时B细胞能够产生抗血小板自身抗体，该抗体的产生受Th细胞及他们产生的细胞因子所控制，因此，在ITP的发病过程中存在Th1/Th2的平衡紊乱以及细胞因子的异常分泌，从而使B细胞出现活化异常进而产生抗血小板抗体，最终导致ITP的发病。有文献[13]报道ITP患者存在T细胞亚群Th1/Th2失衡，而B细胞表面的CD80、CD86表达率明显上升，从而提示两者在ITP发病机制中起一定作用。

笔者的研究结果显示，ITP患者的外周血淋巴细胞CD28表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P0.05），究其原因，可能与试验例数偏少有关，CD86的表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P0.05），且通过随访笔者发现很多患者会出现病情反复，这是否提示目前的治疗方法，如糖皮质激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗体，不能从本质上阻断血小板抗体的产生；是否会有相应的单克隆抗体药物产生，能够通过CD28、CD80与CD86的协同刺激途径，抑制B淋巴细胞的活化，减少血小板自身抗体的产生，达到治疗ITP的作用，这也已然成为ITP治疗研究的新方向。

参考文献

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（收稿日期：2014-07-09） （本文编辑：陈丹云）