同位素稀释―超高效液相色谱―线性离子阱串联质谱分析谷物及其制品中呕吐毒素及其衍生物和代谢物

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摘要 建立了谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、去环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇的同位素稀释超高效液相色谱线性离子阱串联质谱（UHPLCQTRAPMS/MS）定性确证和定量测定方法。样品经乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）混合溶液提取，乙腈饱和的正己烷除脂，HLB固相萃取柱净化，WatersAtlantisT3色V柱分离，以乙腈0.02%氨水溶液为流动相进行梯度洗脱，在负离子模式下，采用多反应监测（MRM）信息依赖性采集（IDA）增强子离子扫描（EPI）模式检测，在线EPI谱库定性分析，同位素内标定量，在1～300μg/L浓度范围内，4种目标物的线性相关系数均大于0.999，检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg，添加5，50和200μg/kg的3个浓度水平，4种目标物的平均回收率均在81.3%～101.7%之间，相对标准偏差均小于5%，将该技术应用于FAPAS阳性玉米质控样品和5种代表性的样品进行测试，结果表明，本方法简单、准确、快速，适用于谷物及其制品中呕吐毒素及其衍生物和代谢物的快速确证和定量测定。

关键词同位素稀释；呕吐毒素及其衍生物和代谢物；超高效液相色谱；线性离子阱串联质谱

1引言

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又称呕吐毒素，其中3乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3AcDON）、15乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15AcDON）是其乙酰化衍生物[1＼]，去环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DOM1）是DON在动物或人体内的代谢产物；这类毒素耐热、耐酸碱，化学性质稳定，在加工储运过程中不易被破坏[2＼]。其毒性表现为急性毒性、免疫毒性、细胞毒性、生殖毒性和三致作用等[3～5＼]，主要污染小麦、大麦、玉米、大米等谷物[6，7＼]，间接造成啤酒、酱油、米粉等谷物制品的污染[8＼]，部分谷物制品中含有动物源性成分，例如婴幼儿米粉和中老年谷物制品中会添加牛奶、鸡蛋、鸡肉、牛肉等，因此DOM1也成为该类制品的污染物。食品添加剂联合专家委员会（JECFA）将原来针对DON的暂定每日容许最大摄入量（PTMDI）改为DON及其乙酰化衍生物组的PTMDI为1μg/kgbw[9＼]。

目前，关于DON及其衍生物的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）[10，11＼]、高效液相色谱法（HPLC）[12＼]和液相色谱质谱联用法（HPLCMS/MS）[13，14＼]，LCMS/MS结合了HPLC法的快速分离性能和质谱高选择性的优点，具高选择性、高分辨率和高灵敏度的特点，能够同时定性和定量分析多种化合物，但此法存在基质效应影响，当样品中目标物残留较低时，采用四级杆质谱定性时，化合物的两对MRM离子比率偏差较大，容易造成定性困难[15＼]。四极杆线性离子阱（QTRAP）系统是混合型串联质谱，既保留了串联四级杆较好选择性与灵敏度，也可作为线性离子阱增强二级碎片离子定，其中多反应监测信息依赖性采集增强子离子扫描（MRMIDAEPI）模式，一次进样可得到用于定量的MRM色谱图及用于定性的二级谱图，与常见的三重四级杆扫描模式相比，增强了二级碎片离子扫描，更有利于增强复杂介质中微量目标化合物的定性能力[16＼]。

本研究采用固相萃取技术实现对目标物的富集和净化，应用同位素稀释法消除基质效应，采用线性离子阱串联质谱（UPLCQTRAPMS/MS）的MRMIDAEPI分析模式进行检测，并建立多能级检索谱库，为呕吐毒素及其衍生物和代谢物的定性和精确定量分析提供更加准确可靠的分析方法。

2实验部分

2.1仪器与试剂

ABQTRAP5500质谱仪（美国ABSciex公司），搭配ShimadzuLC30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；MilliQ超纯水器（美国Millipore公司）；高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；全自动氮吹浓缩仪（美国Biotage公司）；固相萃取装置、WatersOasisHLB（200mg，6mL）固相萃取柱和C18固相萃取柱（500mg，6mL）（美国Waters公司）。

甲醇、乙腈（LCMS级，Merk公司）；正己烷（HPLC级，Merk公司）；氨水（HPLC级，Sigma公司）；水为MilliQ系统纯化水；除已注明外，所用试剂均为分析纯。

DON（（199.9±2.78）μg/mL，美国Smart公司）；3AcDON（（100.5±0.6）μg/mL）、15AcDON（（100.1±1.4）μg/mL）、DOM1（（50.5±1.3）μg/mL）、13C15脱氧雪腐镰刀菌烯醇（13C15DON，100μg/mL）和13C173乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（13C173AcDON，100μg/mL）均购于Sigma公司。

2.2混合标准溶液及内标溶液的配制

混合标准溶液配制：分别精密移取50μLDON，100μL3AcDON，100μL15AcDON和200μLDOM1至10mL容量瓶中，以乙腈定容，配制成混合标准储备液（1000μg/L，

18℃保存，有效期6个月）；准确移取1.0mL混合标准储备液至10mL容量瓶中，乙腈定容，配制成混合标准工作液（100μg/L）。JP

内标溶液配制：分别准确移取100μL13C15DON和13C173AcDON同位素内标储备液至10mL容量瓶中，以乙腈定容，得混合同位素内标溶液（1000μg/L，

18℃保存，有效期6个月）。

2.3样品前处理

2.3.1提取谷物及制品：准确称取2.0g（精确至0.0001g）样品（粉碎的固体样品或脱气后的液体样品），加入适量内标溶液，混匀放置5min，加入15mL乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）混合提取液，超声提取20min，JP再用乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）定容至20.0mL，10000r/min离心10min，取10.0mL上清液，待净化。

2.3.2净化

向待净化的上清液中加入10mL乙腈饱和的正己烷，剧烈振荡20min，5000r/min离心5min，弃上层正己烷萃取液后，45℃用氮气吹至近干，加5mL水复溶，将复溶液经HLB固相萃取柱（先后用5mL甲醇和5mL水活化平衡）萃取，控制流速1～2mL/min，依次用5mL水和5mL甲醇水溶液（5KG-3∶KG-595，V/V）淋洗，抽干后用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮气吹干，用1.0mL初始流动相复溶，超声涡旋溶解1min，过0.22μm有机微孔滤膜后供LCMS/MS分析。

2.4超高效液相色谱串联质谱分析条件

2.4.1超高效液相色谱条件WatersAtlantisT3色谱柱（150mm×2.1mm，5.0μm，美国Waters公司）；柱温：35℃；样品温度：15℃；进样体积：5μL；流速：0.35mL/min；流动相：0.02%氨水溶液（A相），乙腈（B相）；梯度洗脱程序：0～5min，90%～30%A；5～6min，30%A；6～6.1min，30%～90%A；6.1～10min，90%A。

2.4.2质谱分析条件电喷雾负离子模式，喷雾电压4.5kV，雾化器压力（GS1）50PSI，辅助气压力（GS2）50PSI离子源温度500℃，气帘气压力（CUR）40PSI；优化后的母离子、子离子和锥孔电压、聚焦电压、碰撞能量等MRM相关参数见表1。

采用多反应监测MRMIDAEPI模式检测，在线EPI谱库检索辅助定性分析，同位素内标法定量分析，IDA参数：启动阀值5000CPS，采用动态背景扣除模式；EPI参数：扫描速度10000Da/s，扫描范围为m/z50～400Da，采用动态填充阱集时间，不大于1ms，EPI碰撞能量（CE）：20和35eV。

3结果与讨论

3.1色谱条件的优化

选择对极性和弱极性化合物具有较好保留能力的WatersAtlantisT3色谱柱（150mm×2.1mm，5.0μm），比较了乙腈水和甲醇水两种流动相，结果表明，乙腈水作为流动相时，分离度和灵敏度都明

为进一步提高待测化合物的离子化效率，增加灵敏度，结合目前LCMS/MS法检测呕吐毒素的相关报道[14，17＼]，在流动相中添加对负离子有增强作用的氨水，通过比较0.01%～0.04%氨水浓度对灵敏度的影响，最终确定流动相为乙腈0.02%氨水溶液；再优化流动相比例，最终选择线性梯度洗脱，目标物分离度较好、保留时间适中，优化后的多反应监测离子流色谱图见图1。

3.2MRMIDAEPI扫描模式和EPI谱库建立

欧盟规定[18＼]，LCMS/MS法检测有机污染物时，定性确证要求每种化合物选用两对MRM离子，各定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液谱图相比误差不超过±20%，但当目标物浓度较低时，由于质谱信号的绝对响应低，加之受到基质效应的影响，实际检测目标分析物的离子相对丰度容易超出容许限，从而给确证分析结果的判定带来困难[19＼]。本实验采用MRMIDAEPI模式，将优化后的MRM条件作为EPI促发方式，初步设定IDA参数，对10μg/L混合标准溶液进行分析。结果表明，CE值为20和35eV时，可以获得足够的碎片离子信息，并包含特征碎片离子。综合考虑4种化合物EPI质谱图的背景强度，确定MRMIDAEPI模式的参数，进而获得对应MRM通道中母离子的增强二级离子全扫描质谱图，4种目标物在CE为20eV的EPI的扫描结果如图2所示，用于定性分析，同时建立目标物的EPI谱库，用于阳性样品定性时的谱库检索，辅助定性分析。同时MRM通道采集的信号依然可用于定量分析，与普通MRM模式相比，JP由于EPI谱图增强了二级碎片离子全扫描谱图，其灵敏度高于四极杆质谱，确证信息更丰富，而MRM通道采集的信号依然可作为定量分析的数据。因而可以有效辅助痕量水平或检出限浓度样品的定性分析，很好地解决了传统四极杆MRM模式对低浓度样品的定性检测存在的困难[15＼]。

3.3前处理方法

3.3.1固相萃取柱的选择和优化最初采用特异性强的免疫亲和层析净化进行前处理，近年来兴起了特殊填料的多功能净化柱净化，这两种方式虽然净化效果较好，但成本高，应用受到限制[17＼]。本实验采用固相萃取的方式进行样品前处理，可降低成本，简化操作。比较了Waters公司的C18（200mg，6mL）、HLB（200mg，6mL）两种固相萃取柱的净化效果和保留行为，结果表明，HLB（200mg，6mL）对4种呕吐毒素的保留性最；为进一步去除基质干扰，本实验还优化了淋洗液和洗脱液，最终确定淋洗液为5mL水和5mL甲醇水溶液（5KG-3∶KG-595，V/V），洗脱液为5mL甲醇。

3.3.2提取溶剂的选择由于DON及其衍生物和代谢物易溶于水和极性有机溶剂，通过考察各种类型的谷物及其制品发现，纯的谷物（如大米、小麦、小麦粉、玉米、玉米粉等）可以采用纯水提取，但谷物制品种类繁多，一些即食、膨化、冲调后食用的谷物制品加水会变成糊状，无法通过离心等手段进行分离，而一些添加牛奶、鸡蛋、鸡肉、牛肉等成分的谷物制品中蛋白含量高，在水中加入一定比例的乙腈会沉淀蛋白，同时避免糊化现象，本研究结合已有报道和资料[12，17＼]，以及对不同提取溶剂的研究结果，最终确定提取液为乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）。

3.4方法学验证

3.4.1线性范围、检出限和定量限采用混合标准溶液和混合标准工作液，用初始流动相配制成1～300μg/L的系列标准溶液，以13C15DON作为DON的内标，13C173AcDON作为3AcDON、15AcDON和DOM1的内标，以待测物质的峰面积和相应内标的峰面积的比值（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，线性回归方程及相关系数见表2。结果表明，各呕吐毒素在1～300μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；在2g空白大米基质样品中加入20μL混合标准工作液（100μg/L），理论加标浓度为1.0μg/kg，按照已建立方法检测，结果信噪比均大于80，根据标准规定S/N>10为检测下限，S/N>3为检出限，鉴于质谱本身的稳定性、不同仪器间的差异和方法的适用性，确定本方法的检出限0.1μg/kg，定量限0.3μg/kg，如表2所示，本方法的检出限与相关报道基本一致[14＼]，可满足检测需求。

3.4.2方法的回收率和精密度

为了验证方法的准确性和可靠性，在阴性样品大米、小麦粉和啤酒中分别加入混合标准溶液和混合标准工作液，加标水平为5，50和200μg/kg，每个浓度水平按照JP优化后的CM（44方法平行测试6次，回收率和RSD的计算结果见表3。结果表明，DON的回收率为97.5%～101.7%，CM）

相对标准偏差为1.4%～3.3%；3AcDON的回收率为94.1%～1014%，相对标准偏差为1.0%～3.0%；5AcDON的回收率为95.6%～100.5%，相对标准偏差为1.4%～4.4%；DOM1的回收率为81.3%～93.9%，相对标准偏差为1.0%～4.3%；结果表明，在3个水平下，本方法的准确度和精密度良好，可以满足谷物及其制品中DON及其衍生物和代谢物检测的要求。

3.5实际样品验证

3.5.1FAPASS质控样品的验证为了进一ZH（步验证本方法的准确性和适用性，对FAPASS提供的阳性质控玉米粉进行检测，结果如表4所示，DON、3AcDON、15AcDON的检测结果均在质控标示值范围内，且平行测试结果RSD≤5.0%，DOM1未检出，与FAPASS的质控样品的标示值一致，表明本方法适用于实际阳性样品的检测。ZH）

3.5.2阳性样品的分析

应用本方法分析了10份在售谷物及其制品（大米、年糕、玉米粉、酱油、馒头各2份），其中部分样品中有DON，3AcDON，15AcDON，DOM残留，残留量为0.2～5.0μg/kg，以阳性可疑大米样品为例，采用MRMIDAEPI扫描模式对样品进行分析，在保留时间3.5min，获得2个不同的碰撞能量EPI谱图，将样品的EPI谱图在新建的呕吐毒素及其衍生物和代谢物的谱库中进行检索，得到匹配结果，其中Fit值（匹配值）是用标准物质谱图与可疑样品谱图进行对比后获得的相似度值（满分为100），RevFit值（反相匹配值）是反相匹配后获得的相似度值；Purity值（纯度值）是综合前两种结果得出的数值[20＼]，从表5可明显看出样品为DON阳性。使用MRM通道采集的信号进行定量分析，结果为1.2μg/kg，从而实现对样品中DON的快速确证，简化了定性分析流程。

4结论

建立了谷物及其制品中呕吐毒素及其衍生物和代谢物的UHPLCQTRAPMS/MS分析方法，采用MRMIDAEPI分析模式，利用QTrap的线性离子阱功能获得DON，3AcDON，15AcDON和DOM1的增强全扫描二级质谱图，并建立其多能级全扫描检索谱库，同步实现MRM定量检测和在线EPI谱库检索定性确证功能，在样品前处理中采用HLB固相萃取技术实现对谷物及其制品中4种目标化合物的富集和净化，同时在前处理中加入了同位素内标，不但能有效地去除基质效应影响，还能排除前处理过程因样品损失造成的回收率不稳定的问题，与现有标准和已报道的方法相比，本方法检出限更低，定量结果准确，检测成本更低，检测范围更广，分析速度更快，为呕吐毒素及其衍生物和代谢物提供更加准确可靠的定性筛查和定量分析方法。

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AbstractAmethodwasestablishedforthequalitativeidentificationandquantitativedeterminationofDON，3AcDON，15AcDON，DOM1incerealandcerealproductsbasedonsolidphaseextractionandultraperformanceliquidchromatographyquadrupolelineariontrapmassspectrometry（UPLCQTRAPMS/MS）withisotopicdilution.Sampleswereextractedbythemixtureofacetonitrileandwater（84KG-3∶KG-516，V/V），degreasedbyhexanesaturatedwithacetonitrileandpurifiedbyHLBsolidphaseextractioncartridge.ThetargetanalyteswereseparatedbyWatersAtlantisT3columnwithgradientelutionbymobilephaseswhichconsistedofacetonitrileand0.02%ammoniawater.Ascheduledmultiplereactionmonitoring（MRM）innegativemodeassurveyscanandanenhancedproduction（EPI）scanasdependentscaninaninformationdependentacquisition（IDA）experimentwereadoptedinmassspectrometryacquisition.OnlinelabbuiltMS/MSlibraryaswellastheisotopeinternalstandardswasemployedfortheidentificationandqualification.Foreachanalyte，thecorrelationcoefficientwasabove0.999inthelinearrangeof1-300μg/L.Thelimitsofdetection（LOD）andquantitation（LOQ）were0.1μg/kgand0.3μg/kg，respectively.Themeanrecoverywas81.3%-101.7%atthreespikedlevelsof5，50，200μg/kg.Therelativestandarddeviation（RSD）wasnomorethan5%.TheproposedmethodwassuccessfullyappliedtotheanalysisofFAPAS′sQCsamplesandfiverepresentativesamples.Thismethodwassimple，fastandprecise，andsuitableforthedeterminationandconfirmationofdeoxynivalenolanditsderivativesandmetabolitesincerealandcerealproducts.

KeywordsIsotopicdilution；Deoxynivalenolanditsderivativesandmetabolites；Ultraperformanceliquidchromatography；Quadrupolelineariontrapmassspectrometry

HQWT6JY（Received27May2016；accepted13September2016）