人参茎叶霜冻前后的质量变化
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[收稿日期] 2014-05-19
[基金项目] 国家科技支撑计划项目（2011BAI03B01）；国家公益性行业科研专项（201303111）；吉林省科技发展计划项目（20126046，20140204013YY）；吉林省中医药产业发展专项（YYZX201258）；国家自然科学基金项目（31000154）
[通信作者] *张连学，教授，博士生导师，主要研究药用植物栽培与加工，Tel/Fax：（0431）84532952，E-mail：
[作者简介] 赵岩，副教授，硕士生导师，研究方向为天然药物化学成分与生物活性，Tel：13404325685，E-mail：
[摘要] 采用HPLC测定人参茎叶受冻前后单体皂苷、游离氨基酸含量，紫外分光光度法测定总酚含量及DPPH法测定自由基清除能力的变化，考察人参茎叶霜冻前后的质量变化。结果表明，受冻后人参茎中9种单体皂苷含量除Rg1，Re升高外，其余皂苷含量均有所下降，人参叶中皂苷含量均明显降低；受冻后人参茎中游离氨基总含量降低，而人参叶氨基酸总含量升高；受冻后人参茎、叶中的总酚含量降低，但对自由基的清除能力提高。霜冻对人参茎叶质量产生一定的影响。
[关键词] 人参茎叶；霜冻；人参皂苷；氨基酸；DPPH清除率
人参Panax ginseng C. A. Mey.为五加科植物，传统入药部位为根及根茎[1]。人参皂苷是人参的主要生物活性成分，广泛分布于人参各个部位[2]。为了充分利用人参资源，人们对人参的研究拓展到茎叶部分。研究表明，人参茎叶皂苷不仅具有抗肿瘤[3]、抗菌抗病毒[4]、保肝护心[5]、提高免疫[6-8]、促进细胞增殖[9]等作用，在缓解疲劳方面也起到一定的作用[10-11]。吉林省是人参的道地产区，在人参采收季节，地上部分常发生霜冻，可能对人参茎叶中化学成分造成一定影响。目前，还没有这方面的研究报道。课题组通过对人参茎叶受冻前后化学成分及对自由基清除能力的对比研究，探讨霜冻对人参茎叶质量的影响。为人参茎叶药材的生产与利用提供了相关数据参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
人参茎叶药材采自吉林农业大学中药材学院药用植物园[受冻茎叶（131014）和未受冻茎叶（131007）均采集于同株人参，采集十株，形成十对供试药材，阴干，实验时成对对比测试]，经吉林农业大学张连学教授鉴定为五加科植物人参P. ginseng的茎叶。21种氨基酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，纯度均≥98%）；人参单体皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd（吉林大学化学院公共化学教学与研究中心，分析纯，纯度均≥98%），三乙胺、乙腈色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为国产分析纯。
FW-100型高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；KQ-250B超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）；2XZ-4型旋片式真空泵（上海博一泵业制造有限公司）；HH-6B数显恒温水浴锅（上海明桥精密科学仪器有限公司）；TG628A分析电子天平（1/1万）（上海皖衡电子仪器有限公司）；CXTH-3000高效液相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司）；UV-754紫外-可见分光光度计（山东高密彩虹分析仪器有限公司）。
1.2 皂苷含量测定[12]
1.2.1 色谱条件 Promosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，检测波长203 nm，乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～24 min，19.5%～21.5%A； 24～26 min，21.5%A；26～30 min，21.5%～29%A；30～52 min，29%～31.5%A；52～55 min，31.5%～38%A），流速1.0 mL・min-1，进样量20 μL。
1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd适量，加甲醇溶解，配制质量浓度分别为1 g・L-1混合溶液，4 ℃保存。
1.2.3 供试品溶液的制备 取样品0.5 g，精密称定，置于索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸移入50 mL锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇25 mL，密塞，放置过夜，超声处理30 min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，进行色谱分析。
1.2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液0.1～10 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，进行液相分析。以人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd的质量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，可得9种人参皂苷在0.2～20 μg呈良好的线性关系（R2 >0.999 3）。
1.2.5 精密度试验 取混合人参皂苷对照品溶液20 μL，连续进样6 次，测定峰面积。结果，9种人参皂苷峰面积的RSD在0.79%～1.3%，表明仪器精密度良好。
1.2.6 稳定性试验 分别于0，1，2，4，6，8，12，24 h，精密吸取对照品溶液20 μL，注入液相，测定峰面积。结果，9种单体皂苷峰面积的RSD在0.82%～1.4%，表明样品在24 h内稳定。
1.2.7 重复性试验 按上述供试品溶液制备方法，称取同一批供试品6 份。按上述色谱条件进样测定峰面积，计算单体皂苷含量。结果，未受冻人参茎中9种单体皂苷的RSD在0.88%～2.5%，受冻人参茎中9种单体皂苷的RSD在1.1%～1.9%；未受冻人参叶中9种单体皂苷的RSD在1.0%～1.9%，受冻人参叶中9种单体皂苷的RSD在0.98%～2.0%。
1.2.8 回收率试验 称取已知含量的未受冻人参茎、叶及受冻人参茎、叶各0.25 g加入混合单体皂苷对照品溶液适量，按1.2.3项下方法制备供试品溶液，计算各单体皂苷的回收率。结果，未受冻人参茎中9种单体皂苷的平均回收率在98.58%～101.1%，RSD在0.67%～2.0%，受冻人参茎中9种单体皂苷的平均回收率在98.59%～100.1%，RSD在1.3%～1.9%；未受冻人参叶中9种单体皂苷的平均回收率在98.68%～101.3%，RSD在0.96%～2.1%，受冻人参叶中9种单体皂苷的平均回收率在98.49%～99.68%，RSD在0.61%～2.1%。
1.2.9 样品的含量测定 分别精密吸取供试品和对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，采用外标一点法计算含量。
1.3 游离氨基酸含量测定[13]
1.3.1 色谱条件 Ultimate Amino Acid氨基酸色谱专用柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温35 ℃，检测波长254 nm。流动相A：乙腈-水（80∶20）；流动相B：醋酸钠缓冲溶液（pH 6.5）-乙腈（93∶7）。梯度洗脱（0～11 min，0～7%A；11～13.9 min，7%～12%A；13.9～14 min，12%～15%A；14～29 min，15%～34%A；29～32 min，34%～70%A；32～35 min，70%～100%A；35～42 min，100%A；42～45 min，100%～0 A；45～60 min，0 A），流速1.0 mL・min-1，进样量20 μL。
1.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、胱氨酸（Cys-Cys）、半胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、赖氨酸（Lys）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）适量，加0.1 mol・L-1盐酸超声溶解，配制除胱氨酸浓度为1.25 mmol・L-1外，其他氨基酸浓度为2.5 mmol・L-1的混合溶液，4 ℃保存。
1.3.3 供试品溶液的制备 取样品0.5 g，精密称定，50%乙醇溶液超声提取2 次，每次50 mL，每次30 min，合并滤液，于80 ℃水浴挥至近干，0.1 mol・L-1盐酸溶剂并定容至10 mL量瓶中，4 ℃保存。
1.3.4 衍生试剂的制备 衍生试剂A：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混匀，4 ℃保存；衍生试剂B：取异硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL，混匀，4 ℃保存。
1.3.5 溶液的衍生 精确吸取供试品和对照品溶液各200 μL，分别置于离心管中，加入衍生试剂A和B各100 μL，摇匀，静置1 h，加入正己烷400 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45 μm滤膜滤过，进行色谱分析。
1.3.6 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液0.1～10 mL置于10 mL量瓶中，加0.1 mol・L-1盐酸溶剂稀释至刻度，按1.3.4项下方法衍生后进行色谱分析。以各氨基酸峰面积积分值（y）为纵坐标，浓度（x，mmol・L-1）为横坐标，进行线性回归，可得21种氨基酸的检测浓度在0.002 5～2.500 0 mmol・L-1（胱氨酸为0.001 25～1.250 00 mmol・L-1）与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（R2 >0.999 1）。
1.3.7 样品的含量测定 精密吸取衍生后的供试品和对照品溶液各20 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，采用外标一点法计算含量。
1.4 总酚含量测定
1.4.1 福林酚试剂的制备[14] 精密称取100 g钨酸钠（NaWO4・2H2O）和25 g钼酸钠（Na2MoO4・2H2O）于2 000 mL圆底烧瓶中，加入700 mL蒸馏水、85%浓磷酸50 mL和浓盐酸100 mL，充分混匀，以小火回流10 h，再加入150 g硫酸锂（Li2SO4・H2O），50 mL蒸馏水和几滴溴水。开口继续煮沸15 min，使得溴水完全挥发。待溶液冷却并定容到1 000 mL，过滤并置于棕色瓶中，冰箱中低温放置可长期使用，使用前稀释1倍。
1.4.2 对照品溶液的制备 取没食子酸25.0 mg，精密称定，加蒸馏水定容至100 mL棕色量瓶中，得质量浓度为250 mg・L-1的对照品溶液，4 ℃保存。
1.4.3 供试品溶液的制备 取样品10 g，精密称定，80%乙醇超声提取3次，每次100 mL，每次30 min，合并滤液，浓缩，蒸干，80%乙醇定容至10 mL，待用。
1.4.4 标准曲线的制作 精密吸取对照品溶液1.0～6.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，得系列浓度的没食子酸溶液。分别取各浓度溶液0.5 mL，置于25 mL量瓶中，加入蒸馏水10 mL，摇匀，再加入福林酚试剂2.5 mL，7.5%Na2CO3溶液2 mL，蒸馏水定容至刻度，50 ℃水浴下反应5 min，冷却后于760 nm处测定其吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y = 0.001 5x-0.001 3，R2 = 0.999 3。
1.4.5 样品的含量测定 精密吸取供试品和对照品溶液各0.5 mL，分别置于25 mL量瓶中，按照1.4.4中“加入蒸馏水10 mL冷却后于760 nm处测定其吸光度”，采用外标一点法计算含量。
1.5 自由基清除率的测定
1.5.1 DPPH自由基标准曲线的制作 取DPPH自由基对照品0.01 g，精密称定，95%乙醇定容至250 mL量瓶中，得质量浓度为40 mg・L-1的对照品溶液，置4 ℃冰箱中保存备用。分别精密吸取DPPH自由基对照品溶液1～10 mL，95%乙醇定容至10 mL，于515 nm处测定其吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=19.323 4x+0.001 6，R2=0.999 3。
1.5.2 抗氧化活性的测定 采用DPPH自由基清除法测定人参茎叶受冻前后对自由基清除力的变化。取1.4.3项下的溶液作为供试品溶液。取3支试管，分别记为A0，Ai，Aj。A0：95%乙醇3 mL+DPPH自由基对照品溶液3 mL；Ai：供试品溶液3 mL+DPPH自由基对照品溶液3 mL；Aj：供试品溶液3 mL+95%乙醇3 mL。于515 nm处测定吸光度，并计算清除率。清除率= [l-（Ai-Aj）/A0]×100%。
2 结果与分析
取人参茎叶样品，按上述方法处理，平行3次，分别测定并计算9种单体皂苷、游离氨基酸、总酚含量及DPPH自由基清除率。
2.1 霜冻对人参茎叶单体人参皂苷含量的影响
未受冻人参茎叶与受冻人参茎叶中9种单体皂苷色谱图见图1，含量见表1。
A.对照品；B.受冻人参茎；C.未受冻人参茎；D.受冻人参叶；E.未受冻人参叶（图2同）。
图1 人参茎叶中单体皂苷HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of ginsenoside monomers in ginseng stems and leaves
在检测的9种的单体皂苷中，未受冻人参茎含有6 种单体皂苷，且含量由高到低顺序依次为Rb1RfRdRg2Rg1Re。在受冻人参茎中，检测出了5种单体皂苷，其中Rg1与Re含量较高，分别为2.43，1.99 mg・g-1，高于未受冻人参茎；剩余3种皂苷含量顺为RdRg2Rf，均明显低于未受冻人参茎。
未受冻人参叶中检测的9种单体皂苷均含有，其中人参皂苷Rd，Re和Rg1含量较高，分别为20.20，14.50，13.75 mg・g-1。受冻人参叶中，仅含有6 种检测的单体皂苷，且含量均明显低于未受冻人参叶。
现有研究表明[15-16]，人参中含有人参皂苷β-葡萄糖苷酶及人参皂苷α-阿拉伯糖苷酶可将人参皂苷水解。人参茎叶因霜冻导致细胞壁破裂，细胞内的糖苷酶得以释放，将人参皂苷降解，可能是导致受冻人参茎叶皂苷含量降低的主要原因。
2.2 霜冻对人参茎叶游离氨基酸含量的影响
未受冻人参茎叶与受冻人参茎叶中氨基酸色谱图见图2，含量见表2。
图2 人参茎叶中游离氨基酸HPLC图
Fig.2 HPLC chromatograms of free amino acid in ginseng stems and leaves
如表2所示，未受冻人参茎中，除胱氨酸未检测到外，含有其他20种游离氨基酸；其中，谷氨酰胺质量分数最高为1.332 2 mg・g-1，其次为天冬酰胺，质量分数为1.051 1 mg・g-1。在受冻人参茎中，氨基酸总含量降低，然而甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸含量升高。
未受冻人参叶中含有21种游离氨基酸，含量排在前几位的分别是：谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸和精氨酸。受冻后，人参叶氨基酸总含量升高。蛋白酶是一类裂解肽链中肽键的酶，广泛存在于植物体内[17]。人参茎叶因霜冻导致细胞壁破裂，细胞内的蛋白酶得以释放，将人参蛋白降解，可能是导致受冻人参叶氨基酸含量升高的原因，但目前关于人参中蛋白酶的相关研究鲜有报道，其机制还有待进一步研究。
2.3 霜冻对人参茎叶总酚含量及DPPH自由基清除率的影响
人参叶中总酚含量高于人参茎，且人参茎叶受冻后总酚含量均降低，其中人参茎未受冻0.19，受冻0.19，人参叶未受冻0.76，受冻0.42；但DPPH自由基的清除能力反而升高，其中人参茎未受冻84.07%，受冻89.83%，人参叶未受冻92.37%，受冻94.24%。而多数研究表明[18-19]，植物中总酚含量与其对DPPH的清除能力具有一定的正相关性。受冻人参茎叶的这种变化，可能是人参茎叶中多种化学成分改变的综合结果，其机制有待进一步研究。
3 讨论与结论
目前我国中药植物提取物的出口额在中成药、中药材、中药提取物中仅次于中药材，位列第二[20]。2013年，我国中药提取物出口额14.12 亿美元，同比增长21.30%[21-22]。虽然我国出口中药提取物种类较多，但数量较大的产品主要集中在以银杏叶提取物、人参提取物为代表的20种左右。这些产品主要应用于保健品行业[23]。在人参提取物出口份额上，中国占世界的60%以上，并以人参茎叶总皂苷出口为主，主要出口到欧美等发达国家。
在国内，随着人们生活水平的不断改善及保健意识的不断增强，以及中医中药大健康产业的不断发展，以人参及人参茎叶等中药材为基源的保健食品越来越受到重视，其消费量不断激增。这就导致人参及人参茎叶等中药材的提取物需求量不断增大。
本研究着眼于人参采收季节较短，地上部分常发生霜冻，可能对人参茎叶中化学成分及其功效造成一定影响，为此，考察了人参茎叶霜冻前后的质量变化。结果表明，霜冻后，人参茎中人参皂苷、氨基酸及总酚含量显著下降；霜冻后，人参叶中人参皂苷及总酚含量下降，氨基酸含量却是升高的；霜冻后人参茎叶的抗氧化能力提升，其机制还有待进一步研究。本研究对指导人参实际生产和正确评价霜冻对人参茎叶质量的影响具有一定的指导意义。
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