银杏内酯类化合物在大鼠体内的绝对生物利用度研究

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[摘要]研究银杏内酯A（GA）、银杏内酯B（GB）和白果内酯（BB）在大鼠体内的药动学特征及其绝对生物利用度。该实验建立了检测大鼠血浆中GA，GB，BB的LC-MS/MS分析方法，考察大鼠经口服（ig）和静脉注射（iv）给药后血浆中3种银杏内酯类化合物的血药浓度，采用DAS 2.0药动学处理软件，计算GA，GB，BB的药动学参数及其绝对生物利用度。结果显示，GA，GB，BB经大鼠注射给药后的Cmax分别为（513.9±116.9），（701.3±76.0），（5 255.6±476.8） μg・L-1，AUC0-t分别为（960.9±268.5），（779.5±140.6），（7 409.3±1 181.1） μg・h・L-1;灌胃给药后的Cmax分别为（522.9±39.9），（146.8±31.6），（2 711.9±588.9） μg・L-1，AUC0-t分别为（1 760.4±300.7），（636.6±180.3），（16 651.4±1 306.5） μg・h・L-1。GA，GB，BB在大鼠体内的的绝对生物利用度分别为（61.1±10.4）%，（27.2±7.7）%，（56.2±4.4）%。该实验所建立的方法专属性好，灵敏度高，可用于GA，GB，BB在大鼠体内的药代动力学和生物利用度研究。

[关键词]银杏内酯类化合物;LC-MS/MS;药代动力学;绝对生物利用度

Absolute bioavailability of ginkgolide compounds in rats

SI Hai-hong1，2， GENG Ting1，2， SUN Xiao-ping1，2， ZHAO Jie1，2， XUE Jia1，2，

LI Yan-jing1，2， HUANG Wen-zhe1，2， DING Gang1，2， WANG Zhen-zhong1，2， XIAO Wei1，2*

（1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China;

2. State Key Laboratory of New Technology for Processing Traditional Chinese Medicine， Lianyungang 222001， China）

[Abstract]To investigate the pharmacokinetic characteristics and absolute bioavailability of ginkgolide A （GA）， ginkgolide B （GB） and bilobalide （BB） in rats. In this experiment， a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method was established to determine the plasma concentrations of GA， GB and BB in rats after rats were administrated with the three drugs through ig and iv respectively. The main pharmacokinetic parameters and absolute bioavailability of three ginkgolide compounds were obtained by using pharmacokinetic software DAS 2.0. After the inject of GA， GB and BB， the results showed Cmax at （513.9±116.9）， （701.3±76.0）， （5 255.6±476.8） μg・L-1 and AUC0-24 h of （960.9±268.5）， （779.5±140.6）， （7 409.3±1 181.1） μg・h・L-1， respectively; after the oral administration， the results showed Cmax at （522.9±39.9）， （146.8±31.6）， （2 711.9±588.9） μg・L-1 and AUC0-24 h of （1 760.4±300.7）， （636.6±180.3）， （16 651.4±1 306.5） μg・h・L-1， respectively. The absolute bioavailability of GA， GB and BB in rats was （61.1±10.4）%， （27.2±7.7）%， （56.2±4.4）%， respectively. The method established in this experiment has a good specificity and sensitivity and so can be used to study the pharmacokinetics and absolute bioavailability of GA， GB and BB in rats.

[Key words]ginkgolide compounds; LC-MS/MS; pharmacokinetics; absolute bioavailability

doi：10.4268/cjcmm20151436

银杏内酯类化合物属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，是银杏叶中一类重要的活性成分。其中白果内酯（bilobalide，BB）属于倍半萜内酯，银杏内酯A（ginkgolide A，GA）和银杏内酯B（ginkgolide B，GB）为二萜类化合物。药效学研究表明，银杏内酯类化合物是很强的血小板活化因子（PAF）拮抗剂^[1]，具有抗炎、抗休克、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、保护中枢神经系统、保护缺血损伤及抑制器官排斥等药理作用^[2-3]。基于这些优势，银杏内酯类药物成为国内企业争相开发的热门品种。目前，对于银杏内酯类成分的绝对生物利用度研究也有相关报道^[4-6]，但缺少银杏内酯类单体化合物在大鼠体内的绝对生物利用度研究的相关资料。为此，本课题以GA，GB，BB为研究对象，建立了灵敏度好、准确度高的LC-MS/MS定量分析方法，并对各单体化合物在大鼠体内的药动学特征及其绝对生物利用度进行了研究。

1材料

1.1仪器

LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司），API4000+质谱仪（AB SCIEX公司）;HSC-24A型氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）;-70 ℃超低温冰箱（海尔）;XW-80A型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）;ST-16R型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）;Mettler XS205型电子分析天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司）;Millipore Elix 5纯水仪。

1.2试剂与试药

银杏内酯A（批号110862-201310）、银杏内酯B（批号110863-201410）、白果内酯（批号110865-201306）均购于中国食品药品检定研究院;甲苯磺丁脲（tolbutamide，TOL，阿拉丁公司，批号T-0891）;甲醇为色谱纯（Merck公司，批号1716507345）;甲酸为色谱纯（美国ROE SCIENTIFIC INC，批号2B3026）;乙酸乙酯为分析纯（南京化学试剂有限公司，批号12101511747）;水为纯化水。

1.3动物

SD大鼠36只，雄性，体重（200±20） g，由中国人民医学动物实验中心提供，许可证号SCXK（军）2012-0014。

2方法

2.1溶液的配制

2.1.1标准工作液的配制分别取GA，GB，BB对照品适量，用甲醇配制成质量浓度分别为5，5，30 mg・L-1的混标溶液，采用逐级稀释的方法配制成系列混合标准工作液。

2.1.2内标溶液的配制取甲苯磺丁脲适量，精密称定，用甲醇配制成质量浓度为10 mg・L-1的储备液。精密吸取上述储备液1 mL至50 mL量瓶，配制成质量浓度为200 μg・L-1的内标溶液。

2.2给药方案与样品采集

将SD大鼠随机分成静脉（iv）给药组和灌胃（ig）给药组，每组6只。给药剂量分别为：GA静脉组（2 mg・kg-1），GA灌胃组（6 mg・kg-1）;GB静脉组（4 mg・kg-1），GB灌胃组（12 mg・kg-1）;BB静脉组（5 mg・kg-1），BB灌胃组（20 mg・kg-1）;实验前12 h禁食不禁水，各组大鼠分别于给药后0，5，15，30，60，120，240，360，480，720，1 440 min眼眶静脉丛采血0.4 mL，肝素抗凝，5 000 r・min-1离心5 min，收集血浆，-70 ℃冰冻保存。

2.3分析条件

2.3.1色谱条件色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse plus C18柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）;流动相甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱为0～3.5 min，35% A;3.5～6 min，35%～85% A;6～8 min，85%～35% A;8～10 min，35% A;柱温为常温; 流速为0.6 mL・min-1;进样量4 μL。

2.3.2质谱条件离子源为ESI源;离子源温度（TEM）550 ℃;雾化气（GS1）和辅助气（GS2）为氮气，扫描方式为多反应监测（MRM），负离子模式;用于定量分析的检测离子对为银杏内酯A：m/z 453.1/351.1（碎裂电压60 V/碰撞能量25 eV）;银杏内酯B：m/z 423.1/367.1（90 V/20 eV）;白果内酯：m/z 325.0/163.1（70 V/20 eV）;内标（甲苯磺丁脲）：m/z 269.3/170.0（70 V/20 eV）。

2.4生物样品预处理

分别取各给药组大鼠血浆100 μL，加入300 μL含内标（甲苯磺丁脲200 μg・L-1）的乙酸乙酯溶液，涡旋混匀12 000 r・min-1离心5 min，取上清液后，下层再以300 μL乙酸乙酯同法萃取。合并2次上清液，于40 ℃下N2吹干，100 μL甲醇复溶，离心，取上清液进样。

2.5数据处理

数据处理均由AB Sciex Multi Quant 2.1软件自动计算获得，并采用DAS 2.0药代动力学软件，以非房室模型统计分析3种银杏内酯类化合物的药代动力学参数。绝对生物利用度的计算公式见下。

F=AUCig×DivAUCiv×Dig

式中D为给药剂量，iv和ig分别表示静脉注射给药和灌胃给药。

3结果

3.1方法学验证

3.1.1特异性在拟定的分析条件下，得到大鼠空白血浆（KB）、对照品含药血浆及给药血浆样品图谱，见图1。GA，GB，BB保留时间分别为3.55，3.94，1.70 min，内标的保留时间为6.16 min。血浆中的内源性物质不干扰3种银杏内酯类化合物的测定，表明该方法专属性良好。

3.1.2标准曲线与定量下限取大鼠空白血浆80 μL，分别加入系列标准工作液20 μL，使得GA，GB终质量浓度分别为5，10，50，100，200，500，1 000 μg・L-1，BB终质量浓度分别为10，100，200，500，1 000，3 000，6 000 μg・L-1，按2.4项下方法处理后进样分析，以待测物的质量浓度（C，μg・L-1）为横坐标，目标分析物与内标峰面积比（Y）为纵坐标，采用加权（W=1/C2）最小二乘法进行回归运算，得其线性回归方程;同时制备6份定量下限（LLOQ）血浆样本，考察方法的灵敏度。3种银杏内酯类成分的回归方程和线性范围为GA：Y=0.000 22C+0.000 45，r=0.999 1，线性范围5～1 000 μg・L-1;GB：Y=0.000 43C+0.001 9，r=0.997 9，线性范围：5～1 000 μg・L-1;BB：Y=0.000 19C+0.000 19，r=0.998 2，线性范围：10～6 000 μg・L-1。GA，GB，BB的定量下限（LLOQ）分别为5，5，10 μg・L-1，最低检出限（LLOD，S/N≥3）分别为0.5，0.2，0.13 μg・L-1。

3.1.3准确度和精密度取空白大鼠血浆，分别加入不同浓度的混合标准工作液，配制成低、中、高浓度的质控（QC）血浆样本，每一浓度平行制备6份样本，按2.4项下方法处理后进样分析，连续考察3 d，随行标曲。测定浓度与标示浓度比较，求得方法的准确度（RE）与精密度（RSD）。结果3种银杏内酯类成分的日内、日间精密度RSD均小于9.0%;准确度RE-1.3%～13.1%，表明该方法的准确度和精密度均良好。

3.1.4回收率和基质效应取空白大鼠血浆，分别加入不同浓度的混合标准工作液，配制成低、中、高浓度的血浆样本，每个浓度平行制备6份样本，按2.4项下方法处理后进样分析，得目标分析物峰面积为B;取空白血浆进行预处理后获得提取液，以此提取液配制QC样品，氮气吹干后复溶，进样分析，得目标分析物峰面积为C;同时，制备目标分析物等浓度标液，进样分析，得目标分析物峰面积为A。计算提取（绝对）回收率=B/C×100%，考察基质效应=C/A×100%。结果显示，GA，GB，BB的提取回收率为86.0%～93.2%，基质效应为92.4%～110%，符合生物样品的测定要求。

3.1.5稳定性试验取空白大鼠血浆，分别加入不同浓度的混合标准工作液，配制成低、中、高浓度的血浆样本，每个浓度平行制备6份样本，按2.4项下方法处理后，分别立即测定、进样盘放置1 d及室温放置6 h后再进行测定。另取处理前的血浆样本分别考察冻融稳定性（反复冻融3次）和冰冻稳定性（-80 ℃保存30 d），结果发现，各项稳定性结果均符合生物样品的测定要求。

3.2药动学特征及绝对生物利用度评价

大鼠经口服（ig）和注射（iv）给药后，GA，GB，BB的平均血药浓度-时间曲线见图2;采用DAS 2.0软件以非房室模型统计分析其药代动力学参数，见表1。

根据口服（ig）和注射（iv）给药后所得的AUC0-t结果，经剂量校正后，得到GA，GB，BB单体化合物在大鼠体内的的绝对生物利用度分别为（61.1±10.4）%，（27.2±7.7）%，（56.2±4.4）%。

4讨论

4.1分析方法的考察

在优化质谱参数的过程中，银杏内酯A起初选用和文献[7-8]报道一样的母离子，即采用[M-H]-，结果发现MRM图响应较差（检测限约为5 μg・L-1），后通过加入适宜浓度的甲酸水溶液酸化调节，检测到[M+HCOO]-的响应值明显提高（检测限约为0.5 μg・L-1），且稳定性很好，故最终采用[M+HCOO]-作为母离子来检测银杏内酯A。

本研究以LC-MS/MS测定大鼠血浆中银杏内酯类成分的浓度，所建立的方法灵敏、准确，专属性、精密度及回收率等方法学考察结果均较好;选定的内标物质稳定，且对3种银杏内酯类化合物的测定均无干扰;该方法中各指标成分均达到基线分离，可提高检测的灵敏度，适用于多种银杏内酯类成分的同时测定。

4.2生物利用度评价

目前，国内外尚无银杏内酯类单体化合物给予大鼠后的绝对生物利用度研究，Chen F等^[4]研究的是银杏叶标准提取物（GBE50）给予大鼠后银杏内酯类化合物的药代动力学特征，其研究发现，GA，GB，BB的绝对生物利用度分别为53.4%，35.2%，60.4%;本实验得到的GA，GB，BB单体化合物在大鼠体内的绝对生物利用度分别为（61.1±10.4）%，（27.2±7.7）%，（56.2±4.4）%，与该文献报道的较为接近。

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