丹参双相载药乳剂的研制及其质量评价
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[摘要]探讨以乳剂同时载药丹参脂溶性与水溶性成分的可行性，为从制剂学方面综合利用丹参药效成分提供新思路。以丹参酮ⅡA，丹酚酸B为原料，大豆磷脂与帕洛沙姆188为混合乳化剂，甘油为等渗调节剂，采用星点设计-效应面法优选处方，高速剪切法制备初乳，续以高压均质机进行匀化，制备丹参双相载药静脉乳剂，进而考察其药剂学特性与稳定性。所制得产品外观为橙黄色乳状液，平均粒径241 nm，Zeta电位-35.3 mV，其中丹参酮ⅡA载药量为0.5 g・L-1，丹酚酸B载药量为1 g・L-1，长期留样稳定性良好。结果表明研制的乳剂可同时载药脂溶性成分丹参酮ⅡA，水溶性成分丹酚酸B，可为充分发挥丹参的药效奠定制剂学基础。
[关键词]丹参酮ⅡA；丹酚酸B；制备工艺；星点设计；质量评价
丹参酮ⅡA（tanshione ⅡA）、丹酚酸B（salvianolic acid B）是中药丹参的主要有效单体，2010年版《中国药典》丹参药材的指标成分。丹参酮ⅡA是丹参的脂溶性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、保护血管内皮细胞、抗肿瘤等多种活性作用[1-4]；丹酚酸B是丹参的代表性水溶性成分，具有改善缺血、缺氧所致心肌细胞损伤、抗氧化清除自由基、抗前列腺肿瘤、抗肝纤维化等多方面的心血管药理活性[5-8]。根据文献报道，丹参酮ⅡA和丹酚酸B联用可有效提高抗氧化、损伤心脏微血管内皮细胞的保护作用[9]，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞[10]。然而，丹参酮ⅡA溶解度极低，严重影响了其普通制剂的生物利用度[11]。另一方面，乳剂作为一种水油两相的优良载体，可同时包载脂溶性和水溶性药物，有利于充分发挥丹参的治疗作用。为此，本研究拟探讨以乳剂同时载药丹参脂溶性与水溶性成分的可行性，为从制剂学方面综合利用丹参药效成分提供新思路。
1 材料
EF-C5高压均质机（加拿大Avestin）；A-88组织捣碎匀浆机（江苏省金坛市医疗仪器厂）；LC-10AT高效液相色谱仪（日本岛津）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Malvern-3000粒径及Zeta电位测定仪（英国）。
丹参酮ⅡA（纯度99.1%，西安天丰生物科技有限公司）；丹参酮ⅡA对照品（中国食品药品检定研究院，批号110766-200716）；丹酚酸B（纯度98.2%，成都曼斯特生物科技有限公司）；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号111562-201009）；注射用中链油（铁岭北亚药用油有限公司）；注射用大豆磷脂（上海太伟药业有限公司）；注射用甘油（汕头古汉紫光氨基酸有限公司）；帕洛沙姆188（PluronicF68，德国BASF）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 丹参双相载药乳剂的制备
2.1.1 油相和乳化剂的筛选 在制剂处方中，油相作为溶解丹参酮ⅡA的载体，决定了其载药量。乳剂油相常用注射用大豆油、中链油、油酸乙酯等[12]。据此，称取适量丹参酮ⅡA，置具塞锥形瓶中，分别加入大豆油、中链油、混合油（大豆油-中链油1∶1），于37 ℃恒温水浴振摇48 h平衡，使丹参酮ⅡA在油相中过饱和。精密称取过滤后的丹参酮ⅡA油溶液0.5 mL至50 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解，定容，过滤，取续滤液，按2.2.2项色谱条件测定各油相中丹参酮ⅡA的溶解度，其在注射用大豆油、中链油、混合油中的溶解度分别为5.97，12.16，9.58 g・L-1。因此，选择中链油作为油相。一般乳化剂在制剂中的主要作用是给予处方足够的乳化能力，因此药物在乳化剂中的溶解度不是筛选乳化剂的关键因素，而安全性和乳化能力才是选择乳化剂的主要因素。根据乳剂经典处方[13]，以阴离子型大豆磷脂为乳化剂，非离子型泊洛沙姆188为助乳化剂。
2.1.2 星点设计优化处方 在预实验的基础上，初步确定注射用油为中链油， 大豆磷脂为乳化剂，泊洛沙姆188为助乳化剂，制得的乳剂外观均一，离心条件下稳定。在此基础上，主要考察注射用大豆磷脂用量（X1，%）、泊洛沙姆188用量（X2，%）和注射用中链油用量（X3，%），并设定其用量范围为X1：0.6%～1.8%；X2：0.1%～0.5%；X3：10%～30%。采用3因素星点设计，以平均粒径（Y）为指标，见表1，测定结果见表2。
对实验数据进行二次多项式拟合，模型为Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b11X12+b22X22+b33X32+b12X1X2+b23X2X3+b13X1X3，以此模型对数据进行拟合，得回归方程为Y=617.545-392.075X1-294.596X2-7.968X3+139.187X12+415.184X22+0.175X32-11.574X1X2+1.401X2X3+0.117X1X3（r=0.969 9），根据拟合方程，绘制X1，X2，X3对Y影响的效应面图，见图1。大豆磷脂及泊洛沙姆188含量越高时，乳剂粒径越小，油相的含量对乳剂粒径的影响最小。综合上述效应面图，根据自变量最优值预测范围，最终确定优选的处方为大豆磷脂用量为1.2%、泊洛沙姆188用量为0.5%、中链油用量为15%。将优选处方代入二项式拟合模型，计算求得指标预测值为230 nm，以此优选配方制备3批静脉乳剂样品，测定其平均粒径为241 nm，模型预测与实测值偏差为4.5%，表明试验得到的拟合方程可较好地描述因素与指标的关系，可用于优化处方及预测其平均粒径。
2.1.3 制备工艺优化 确定注射用中链油（15%），注射用大豆磷脂（1.2%），泊洛沙姆188（0.5%），注射用甘油（3%）。在此基础上考察乳化温度、均质次数、均质压力对乳剂粒径的影响。各因素安排见表3。
用L9（34）正交设计表进行处方筛选。按表3所示制备乳剂后，以粒径测定结果为指标进行工艺筛选，结果见表4，以粒径均匀且粒径较小为好。
各因素对粒径的影响主次顺序是C，A，B，说明均质压力、乳化温度和均质次数对粒径的影响依次减弱。PDI越小，说明微粒大小分布越集中，乳剂稳定性越好。多次试验所测得PDI均小于0.2，说明乳剂微粒大小分布较均匀，且平均粒径较大时PDI值相应呈增大趋势，但二者间并不存在线性关系。由此得出各因素最优化组合为A2B3C3。在实际操作中，考虑到均质5次，采用150 MPa时均质速率很慢，影响乳剂中药物的稳定性，因此选择均质3次，均质压力为100 MPa。通过分析正交设计表筛选得最佳制备工艺乳化温度为70 ℃，均质3次，均质压力100 MPa。
2.1.4 丹参双相载药乳剂的制备 称取处方量的丹酚酸B和注射用甘油溶解于处方量注射用水中；另取注射用大豆磷脂（1.2%）、泊洛沙姆188（0.5%），搅拌下依次加入水相溶液，加热至70 ℃
备用；取处方量丹参酮ⅡA溶解于注射用中链油（15%）中，加热至70 ℃备用。将水相溶液转移至组织捣碎机，于1万 r・min-1高速搅拌下缓缓滴入油相，滴毕，继续高速搅拌8 min，得初乳；将初乳转移至高压均质机中，于100 MPa压力下循环均质3次，得橙黄色均一乳液，充氮，灌装于棕色安瓿中，熔封，121 ℃热压灭菌8 min，即得丹参双相载药乳剂。灭菌后，乳剂外观、粒径、Zeta电位及载药量无明显变化。
2.2 丹参双相载药乳剂质量评价
2.2.1 粒径及Zeta电位 取丹参双相载药乳剂用蒸馏水稀释500倍，摇匀，用激光散射粒径分布及Zeta电位测定仪测定其平均粒径为241 nm，Zeta电位为-35.3 mV。
2.2.2 丹参酮ⅡA载药量 采用HPLC[15]，Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇-水（75∶25），检测波长270 nm。取1 mL乳剂，置25 mL棕色量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；精密称取经P2O5减压干燥24 h的丹参酮ⅡA对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成40 mg・L-1的对照品溶液；精密量取供试品溶液与对照品溶液各20 μL进样分析。丹参酮ⅡA的载药量为 0.5 g・L-1。
2.2.3 丹酚酸B载药量 采用HPLC[15]，Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇-乙腈-甲酸-水（34∶10∶1∶55），检测波长286 nm。供试品溶液的制备同2.2.2。精密称取SAB对照品适量，置棕色量瓶中，加75%甲醇溶解并定容至刻度，制成40 mg・L-1的对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20 μL进样分析。丹酚酸B的载药量为1 g・L-1。
2.3 双相载药乳剂的稳定性考察
2.3.1 离心加速试验 取乳剂，以4 000 r・min-1离心15 min未见分层；以15 000 r・min-1离心15 min有轻微分层，振摇后恢复原状，静置24 h未见再次分层。
2.3.2 长期试验 取乳剂，25 ℃下避光放置6个月，于0，3，6月取样，检测乳剂的外观形状、平均粒径、Zeta电位和质量分数，结果见表5。双相载药乳剂理化性质稳定，各项指标均无明显变化。
3 讨论
在给药系统制备工艺及处方筛选中，常需考察多个因素的多个水平，为减少试验次数并考察因素
间的相互作用，需用试验设计法。丹参双相载药乳剂的制备受到若干因素如乳化剂用量、均质压力、均质次数等影响，本研究采用正交试验考察了乳化温度、均质次数和均质压力对乳剂平均粒径的影响，但有的因素对试验结果的影响并非线性，选用二项式或更高次多项式往往会得到较好的效果。因此，本试验尝试采用星点设计优化乳化剂及油相用量，以物理外观、平均粒径、Zeta电位、离心稳定性、载药量等作为评价指标，其中平均粒径越小，Zeta电位及载药量越大越好。当减小粒径时，乳剂更稳定，但是载药量减小；当提高载药量时，粒径可能变大，提高乳剂的不稳定性，这些均是不利因素，综合这些指标优选的条件才是最佳选择。通过优化，处方实测值与预测值吻合较好。
本实验在油水两相载入丹参酮ⅡA和丹酚酸B，由于其含有极性和离子化基团从而具有表面活性作用，药物表面的电荷可以吸附至乳滴界面[16]，且这些表面电荷的存在会影响粒子周围电荷（离子）的不规则分布以及分散体系中粒子表面和电中性溶液间的电压（或电场）的建立，从而影响乳剂的稳定性。而乳剂的稳定性主要决定于所用表面活性剂的化学组成[17]。本研究采用大豆磷脂和泊洛沙姆188作为混合乳化剂，提高了乳剂的稳定性，可能是在油-水界面形成了泊洛沙姆与磷脂的复合凝聚膜[13]。
丹参酮ⅡA对光不稳定，因此在乳剂制备过程中应注意避光，采用棕色安瓿作为其包装材料。由于受到载药量、稳定性等因素的影响，目前乳剂所载药物多为单一成分，载体药物负荷低。近年来虽有复方乳剂的相关报道[18-20]，但大部分为包载2种脂溶性药物，同时包载脂溶性和水溶性药物的相关文献报道极少。本实验在中医理论的指导下，将脂溶性成分丹参酮ⅡA和水溶性成分丹酚酸B 2种药物包载于同一载体中，充分发挥其协同作用。长期试验结果表明，本试验制备的双相载药乳剂在室温条件下避光放置半年，其物理外观、平均粒径、Zeta电位、含量均无明显变化，表明该乳剂在室温条件下稳定。综上，本实验研制的乳剂可同时载药脂溶性成分丹参酮ⅡA、水溶性成分丹酚酸B，为充分发挥丹参的药效奠定了制剂学基础。
[参考文献]
[1]Chu T， Zhang Q， Li H， et al.Development of intravenous lipid emulsion of tanshinone IIA and evaluation of its anti-hepatoma activity in vitro[J].Int J Pharm，2012，424（1）：76.
[2]Xu Y X， Tian F， Li R， et al.Tanshinone IIA inhibits invasion and metastasis of human hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J].Tumor，2009，95（6）：789.
[3]Lee W Y W， Chiu L C M， Yeung J H K.Cytotoxicity of major tanshinones isolated from Danshen（Salvia miltiorrhiza） on HepG2 cells in relation to glutathione perturbation[J].Food Chem Toxicol，2008，46（1）：328.
[4]俞永梅，牟娜，张平.HPLC测定参芪生肌颗粒中隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量[J].中国现代应用药学，2013，30（4）：425.
[5]高枫，孙桂波，任小宇，等. 丹酚酸B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国中药杂志，2012，37（3）：358.
[6]郭利平，杜嵘，张萌，等.丹酚酸B预适应对缺氧/复氧损伤的心脏微血管内皮细胞蛋白激酶 C-mRNA表达的影响[J].天津中医药，2004，21（4）：325.
[7]吕炳强，范英昌，孙连胜.丹酚酸B、丹参酮IIA对动脉粥样硬化家兔血清一氧化氮及甘油三酯的影响[J].天津中医学院学报，2006，25（1）：32.
[8]王智森，韩桂茹，高飞，等.归丹沙棘胶囊的快速薄层鉴别与二苯乙烯苷和丹酚酸B同时测定[J].中国现代应用药学，2013，30（8）：886.
[9]张萌，张伯礼，高秀梅，等.丹酚酸B和丹参酮ⅡA不同配比对肿瘤坏死因子α损伤大鼠心脏微血管内皮细胞的影响[J]. 中草药，2004，35（1）：63.
[10]李旭，王亚玲.丹酚酸B及丹参酮ⅡA诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞[J].中国组织工程研究，2013，17（10）：1849.
[11]Chen X ， Zhou Z W， Xue C C， et al. Role of P-glycoprotein in restricting the brain penetration of tanshinone ⅡA， a major active constituent from the root of Salvia miltiorrhiza Bunge， across the blood-brain barrier[J]. Curr Drug Metab，2007，8（4）：325.
[12]Lee J M， Park K M， Lim S J， et al. Microemulsion formulation of clonixic acid： solubility enhancement and pain reduction[J].J Pharm Pharmacol，2002，54（1）：44.
[13]陆彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社，2005：82.
[14]曾振兴，杨菲，冯伟红，等.HPLC测定市售丹参饮片中丹参酮ⅡA[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（16）：86.
[15]夏明.RP-HPLC法测定丹七片中丹酚酸B的含量[J].中华中医药杂志，2010， 25（11）：1880.
[16]张小娟，李竹雯，李树，等.脂肪乳剂理化性质和稳定性的影响因素浅析[J].现代生物医学进展，2010，10（18）：3581.
[17]陈立亚，于宝珠，赵慧芳.Zeta电位及其在药学分散体系研究中的应用[J].药物分析杂志，2006，26（2）：281.
[18]吴畏，杨征，陈雅，等.复方奥硝唑乳剂的制备与质量控制[J].药物制剂，2005，24（4）：322.
[19]Ye-Ling Y，Yan L，Xing T，et al. Formulation， Preparation and evaluation of an intravenous emulsion containing Brucea javanica oil and Coix seed oil for anti-tumor application[J].Biol Pharm Bull，2008，31（4）：673.
[20]郭增军，李慧，龙丽辉，等.丹参双相载药亚微乳注射液的研制[J].沈阳药科大学学报，2009，26（2）：85.
Development of biphasic drug-loading lipid emulsion of Salvia miltiorrhiza and
its quality evaluation
WANG Yin-yan， LI Xi， LAI Xiu-jun， LI Wei， YANG Ya-jing， CHU Ting， MAO Sheng-jun*
（Key Laboratory of Drug Targeting and Drug Delivery System， Ministry of Education， West China School of
Pharmacy， Sichuan University， Chengdu 610041， China）
[Abstract] The feasibility of simultaneously loading both liposoluble and water-soluble components of Salvia miltiorrhiza in emulsion was discussed， in order to provide new ideas in comprehensive application of effective components in S. miltiorrhiza in terms of technology of pharmaceutics. With tanshinone ⅡA and salvianolic acid B as raw materials， soybean phospholipid and poloxamer 188 as emulsifiers， and glycerin as isoosmotic regulator， the central composite design-response surface method was employed to optimize the prescription. The coarse emulsion was prepared with the high-speed shearing method and then homogenized in the high pressure homogenizer. The biphasic drug-loading intravenous emulsion was prepared to investigate its pharmaceutical properties and stability. The prepared emulsion is orange-yellow， with the average diameter of 241 nm and Zeta potential of -35.3 mV. Specifically， the drug loading capacity of tanshinone ⅡA and salvianolic acid B were 0.5 g・L-1 and 1 g・L-1， respectively， with a good stability among long-term retention samples. According to the results， the prepared emulsion could load liposoluble tanshinone ⅡA and water-soluble salvianolic acid B simultaneously， which lays a pharmaceutical foundation for giving full play to the efficacy of S. miltiorrhiza.
[Key words] tanshinone ⅡA； salvianolic acid B； preparation process； central composite design； quality evaluation
doi：10.4268/cjcmm20141917