内异方对子宫内膜异位症模型大鼠血清及腹腔液IL-2、TNF-α的影响作用

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摘要：目的：探讨蔡氏内异方对子宫内膜异位症血清及腹腔液中细胞因子IL-2，TNF-α的影响作用。进一步阐明蔡氏内异方的作用机理 方法：采用ＳＤ大鼠自体移植建立ＥＭ模型，采用ELISA法检测血清及腹腔液中IL-2，TNF-α的含量。结果：TNF-α在模型组大鼠腹腔液及血清中都明显高于正常组，中药干预组TNF则明显低于模型组。IL-2水平在模型组大鼠血清中低于正常组，而腹腔液中il-2则明显高于正常组，中药干预组血清中IL-2水平升高，腹腔液中水平下降。结论：血清及腹腔液中细胞因子IL-2，tnf-α水平的不同改变与子宫内膜异位症的发病有关，内异方通过调整IL-2，TNF-α的水平，改善全身和局部免疫水平，协调免疫平衡而达到治疗效果。

关键词：子宫内膜异位症；内异方；白细胞介素-2；肿瘤坏死因子

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0537-03

Effects of Neiyifang on IL-2 And TNF-α in Serum And

Peritoneal Fluid of EM's Model Rats

FU Jinrong1，ZHENG Jin1，WANG Fang2，XU Huayun2，TIAN Lixia1

(1.Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032,China;

2.Longhua Clinical Medical Institute Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032,China)

Abstract:Objective: To investigate the effects of Neiyifang on expressions of IL-2 and TNF-αin Ems'serum and peritoneal fluid. To clarify the mechanism.Methods: The model of Ems in SD rats was duplicated by autologous transplantation，the contents of IL-2 and TNF-α in serum and peritoneal fluid were detected by ELISA. Results: The level of TNF-α in serum and peritoneal fluid in the model group was clearly higher than the normal group, in the TCM group was clearly lower than the model group, the level of TNF was clearly lower than that in the model group. The level of IL-2 in serum was lower than that in the nomal group,while in peritoneal fluid was clearly higher than that in the model group and the TCM group . The content of IL-2 increased in serum while decreased in peritoneal fluid.Conclusion: The different changes of IL-2 and TNF-α in serum and peritoneal fluid were related to the occur of Ems,Neiyifang treating Ems is related to adjusting the levels of IL-2 and TNF-α ,improving the whole body's and local immunity function and coordinating the balance of immunity.

Key words:endometriosis; Neiyifang; interleukin-2; tumor necrosis factor

收稿日期：2011-10-08

基金项目：上海市科委专项基金资助项目[09dz（9）6800]

作者简介：付金荣（1967-），女，江西九江人，主任医师，硕士研究生导师，博士，研究方向：中医药防治子宫内膜异位症的临床及实验研究。子宫内膜异位症(简称内异症,endometriosis,EM)患者80 %有痛经,50 %合并不孕,给育龄妇女健康和生活质量带来巨大的影响〔1〕。近年来的研究表明，内异症患者腹腔液中巨噬细胞数量增多，活性增强，这些巨噬细胞通过释放多种活性物质如细胞因子IL-2、TNF-α、TGF-β、IL-6等，干扰了生殖过程中的某些环节，引起不孕。

导师蔡小荪教授采用活血化瘀散结法治疗异症取得满意疗效。临床不仅能改善异症疼痛症状，且能明显提高受孕率。蔡氏内异方（茯苓、桂枝、皂角刺、石见穿、水蛭等）具有活血化瘀、软坚散结的作用，其初步作用机理能调整内分泌，降低前列腺素水平。本研究通过观察内异方对子宫内膜异位症模型大鼠腹腔液及血清IL-2、TNF-α的影响。进一步探讨该方的作用机理。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级雌性SD大鼠50只，体重（200±20）g，由上海中医药大学实验动物中心提供。（合格证号：SCXK（沪）2007-0005）

1.2主要药品、试剂“内异方”水煎剂（组成药物：云茯苓、桂枝、皂角刺、石见穿、莪术、水蛭等），购自上海中医药大学附属龙华医院，由上海中医药大学实验动物中心煎制，孕三烯酮片（北京紫竹药业有限公司生产，批号：53030402），2.5mg/粒，酶联免疫试剂盒，由钰森生物科技有限公司提供。

1.3模型制备参照Masahiro（Am J obstetGynecol 1990，160:1679-1684）方法行大鼠自身种植内膜，造模成功评判标准是：成功异位内膜有积液形成突起，并测量成活内膜长、宽、高，计算其体积，凡积液高度>1.5mm均筛选出作为成功模型，并选出一只送病检。然后随机分组，而正常组按上述方法行二次开腹，切除左侧子宫一段，但不行种植。所有动物喂养3周,每日行阴道涂片，显微镜下观察，选择无情期处死动物,取材。

1.4分组给药将造模成功的大鼠随机分为模型组、中药组、西药组，每组12只，正常组12只，正常组及模型组均灌胃2mL生理盐水，中药组给予内异方，按25.2g・kg-1・d-1将中药煎液加热浓缩成2mL，使2mL药量效价相当于成人一天的用药量，每日灌胃2mL。西药对照组：采用孕三烯酮，按2.5mg・kg-1・d-1计算，按1∶10的比例溶解成混悬液每日灌胃2mL。

1.5检测指标给药3周结束后，将大鼠麻醉后开腹，腹主动脉取血4～5mL，离心后提取上清液放入-20℃保存待检。吸管吸取腹腔液2mL与血清同条件保存。采用酶联免疫法测定IL-2、TNF-α蛋白浓度。药盒由钰森生物科技有限公司提供。按药盒说明书操作。

1.6统计学方法采用SPSS 18.0统计软件处理，计数资料用±s表示，采用单因素的方差分析。

2结果

2.1模型大鼠血清IL-2、TNF-α的水平变化结果显示，与正常组相比，模型组的IL-2水平降低,差异有统计学意义，使用中药干预后，IL-2水平升高，与模型组相比，差异有统计学意义（P

3讨论

子宫内膜异位症是有着多种复杂病因的多因素疾病,是集免疫、炎症、内分泌各方面紊乱于一身的综合征。近年来通过对子宫内膜异位症分子水平的研究, 各种细胞因子及细胞免疫在发病中的作用越来越得到认同。

TNF-α是体内炎性反应和一系列病理生理过程的重要介质,它主要由单核巨噬细胞产生,是具有多项生物学效应的细胞因子,并参与免疫过程,在剂量低时主要表现为免疫调节作用,浓度高时则易引起病理损伤,从而在许多疾病的发病机制中起着重要的作用[2] 。Hornung［3］ 等研究认为，TNF-α 通过诱导异位子宫内膜炎性细胞因子MCP-1、IL-6、IL-8 等的释放，促进异位内膜及基质细胞增殖、炎性细胞浸润、新生血管生成、组织黏连，从而形成异位病灶。Sakamoto 等［4］研究证实，TNF-α 的异常生成与EMs 患者不孕密切相关，TNF-α 通过影响的活动力和卵母细胞的发育可导致不孕，TNF-α的水平在腹腔液和外周血中都随着病情的加重而升高。本实验结果同样显示：模型组大鼠血清及腹腔液中的TNF-α的水平均显著高于正常组，而中药干预组及西药对照组均显著低于模型组。

IL-2 主要由T 细胞或T 细胞系产生, 可诱导细胞毒性T 淋巴细胞( CTL) 、自然杀伤细胞( NK) 和由淋巴激活的杀伤细胞( LAK) 等多种杀伤细胞的分化和效应功能，对机体IL-2水平的检测,是评估机体免疫活化状态的一个指标。张淑芝等[5]的研究结果显示,异位症合并不孕患者腹腔液及腹腔液中淋巴细胞培养上清液中IL-2活性明显高于对照组,其腹腔液淋巴细胞转化率明显增加,并且IL-2与淋巴细胞转化率之间具有明显的直线正相关。国外学者通过将IL-2给予小鼠,发现其对植入前的胚泡有毒性作用,能抑制正常妊娠[6]。我们的实验结果显示：大鼠模型组血清中IL-2水平低于正常组，而腹腔液中IL-2水平则显著高于正常组，由此推测,血清中IL-2水平的降低,导致Th1细胞功能降低,其介导的细胞免疫功能降低,从而使异位灶在体内无法清除。腹腔液中的IL-2水平增高可能是当机体发生内异症后，异位的子宫内膜作为抗原刺激患者的免疫系统，诱发机体产生体液和细胞免疫应答，导致其腹腔液中巨噬细胞数量与活化程度均显著增加，从而诱导白细胞介素-2的分泌［7-8］。中药内异方能显著降低腹腔液中IL-2水平。

综上所述，异症模型大鼠血清及腹腔液中存在TNF-α、IL-2的水平改变，与EMs 的产生及进展关系密切。内异方通过调整IL-2，TNF的水平，改善全身和局部免疫水平，协调免疫平衡而达到提高受孕率的效果。孕三烯酮具有较强的抗孕激素和抗雌激素活性，直接作用于子宫内膜和异位的子宫内膜受体，发挥抗孕激素和抗雌激素作用，使内异灶萎缩。同时也能显著降低血清及腹腔液TNF-α水平，降低腹腔液中IL-2的水平，孕三烯酮可能通过上述双重作用达到治疗目的。但临床孕三烯酮有服药期间不能受孕的缺点。

参考文献

［1］史常旭.子宫内膜异位症的临床研究现状与展望［J］.重庆医学, 2010，39（2）：129-130.

收稿日期：2011-10-09

基金项目：湖南省中医药科技计划资助项目(2009089)

作者简介：夏苏英(1964-)，女，湖南人，主任医师，硕士研究生导师，硕士，研究方向：中西医结合治疗心脑血管疾病的临床与科研。［2］Wolf AM,Wolf D, Rumpold H, et al. The kinase inhibitor imatimib misylate inhibits production in vitro and p revents dependent acute hepatic inflammation［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 ( 38 ) :13622-13627.

［3］Hornung D，Klingel K，Dohrn K， et al． Regulated on activation，normal T-cell-expressed mRNA expressed and secreted mRNA expression in normal endomerium and endometriotic implants: assessment of autocrine /paracrine regulation by in situ hybridization［J］． Am J Pathol，2001， 158( 6) : 1949-1954．

［4］Sakamoto Y，HaradaT，Horie S， et al． Tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-8 ( IL-8) expression in endometriotic stromal cells，probably through nuclear factorkappaB activation: gonadotropin-releasing hormone agonist treatment reduced IL-8 expression［J］． Clin Endocrinol Metab， 2003， 88( 2) : 730-735．

［5］张淑芝,王慧贤,等.子宫内膜异位症并不孕患者腹腔液淋巴细胞及其白细胞介素-2的变化[J].中华妇产科杂志,1998,33(1):17-19.

［6］Tezabwala BU,Johnson PM,Rees PC.Inhibition of pregnancy a-bility in mice ollowing IL-2administration[J].Immunology,1989,67:115-119.

［7］Robert N，Michael D． Angiogenic factors in Endometriosis ［C］． Mueller Annals of the New York Academy of Sciences，2002， 955: 89-92．

［8］刘燕，熊员焕．子宫内膜异位症的免疫机制研究进展［J］．南昌大学学报(医学版)，2010，50(1):133-135．