mdig基因在人胰腺癌中的表达及其促癌作用
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[摘要] 目的 研究mdig基因在胰腺癌细胞中的表达情况，探讨mdig与胰腺癌发生发展的关系及其作用的可能机制。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（Q-PCR）和Western blot方法检测mdig在胰腺癌细胞PANC1和MIAPaca2与正常胰腺导管上皮细胞HPDE6c7中表达的差异。将转染mdigsi RNA质粒的胰腺癌细胞PANC1和MIAPaca2设为实验组，将转染空载质粒的胰腺癌细胞PANC1和MIAPaca2设为对照组，用CCK8法和流式测凋亡法分别检测两组细胞的增殖和凋亡情况；用Western blot检测两组细胞的Sox2基因表达情况。 结果 与正常胰腺导管上皮细胞HPDE6c7相比，mdig基因在胰腺癌细胞PANC1和MIAPaca2中表达均上调（P < 0.05）。与对照组相比，实验组细胞的增殖率下降（P < 0.05），凋亡率增高（P < 0.05），Sox2的表达下调（P < 0.05）。 结论 mdig在胰腺癌细胞中表达升高，并可能通过介导原癌基因Sox2发挥促癌作用。
[关键词] 胰腺癌；矿物粉尘诱导基因；增殖；凋亡
[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（b）-0012-04
Expression of mdig gene in human pancreatic carcinoma and its role in promoting cancer
LUO Hesheng1 ZHAN Ting1 TIAN Xia HUANG Xiaodong2
1.Department of Gastroenterology， People's Hospitial of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2. Department of Gastroenterology， Tongren Hospital of Wuhan Univerity， Hubei Province， Wuhan 430060， China
[Abstract] Objective To study the expression of mdig in pancreatic cancer cells， in order to explore the relationship between mdig and the development of pancreatic cancer and its possible mechanism. Methods The expression of mdig in pancreatic cancer cells and normal pancreatic ductal epithelial cells were detected by Q-PCR and Western blot. The pancreatic cancer cells PANC1 and MIAPaca2 transfected with mdigsi RNA plasmid were designated as the experimental group， and the pancreatic cancer cells PANC1 and MIAPaca2 transfected with empty plasmid were designated as control group， the proliferation of two groups of cells was detected by CCK8， the apoptosis of two groups of cells was detected by flow cytometry， the expression of Sox2 in two groups of cells was detected Western blot. Results Compared with normal pancreatic ductal epithelial cells HPDE6c7， the expression of mdigin pancreatic cancer cells PANC1 and MIAPaca2 was up-regulatede. Compared with the control group， the proliferation rate of the experimental group was decreased （P < 0.05）， the apoptosis rate was increased （P < 0.05）， and the expression of Sox2 was down regulated （P < 0.05）. Conclusion The expression of mdig in pancreatic cancer cells increases， and mdig may regulate the expression of Sox2 to promoting the occurrence of pancreatic cancer.
[Key words] Pancreatic cancer； Mdig； Proliferation； Apoptosis
近年恚胰腺癌的发生率和死亡率逐渐升高，已成为癌症致死的第4位病因[1]，它的侵袭性生长和早期转移扩散使其成为最具侵袭性的肿瘤之一，约40%患者在确诊时已经发生局部或远处转移，失去根治性手术的机会[2]。随着研究的深入发现，肿瘤的发生往往是多种基因共同作用的结果[3-4]因此可以通过研究与胰腺癌发病密切相关的基因，从而在分子水平上寻找其中的关键基因并开发相应的靶向治疗。矿物粉尘诱导基因（mineral dust induced gene，mdig）于2005年作为一种新肺癌基因被发现[5]，随后被证实与mina53基因是同一种基因，而mina53基因是原癌基因c-myc的靶基因[6]。越来越多的研究证实mdig基因是一种重要的肿瘤相关基因，与某些肿瘤的发生与发展密切相关，并且已经有报道发现mdig在人类结肠癌[7]，食管鳞状细胞癌[8]、肝细胞癌[9]、胆管细胞癌[10]表达均升高。然而，目前只有极少数关于mdig基因在胰腺癌组织中的表达情况的报道，而且其表达情况的定量研究及其与胰腺癌发生发展的关系还未见报道。本研究拟探讨mdig基因在胰腺癌细胞中表达状况及其促癌作用并探讨其发挥作用的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞系及细胞培养
人胰腺癌细胞PANC1、MIAPaca2以及人正常胰腺导管细HPDE6c7（H6c7）购自中国科学院上海细胞库。细胞用含10%胎牛血清（NQBB，USA）、1%双抗（Thermo Fisher Scientific，美国）的完全培养基培养并置于37℃，含5% CO2的培养箱中。
1.2 细胞转染
mdigsi RNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。细胞转染前24 h接种于六孔板中，使细胞第2天的细胞融合率为70%左右。按照说明书操作步骤用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）和mdig基因的干扰质粒或空载质粒转染细胞4～6 h后，换液继续培养细胞。将转染mdigsi RNA质粒的胰腺癌细胞PANC1和MIAPaca2设为实验组，将转染空载质粒的胰腺癌细胞PANC1和MIAPaca2设为对照组。
1.3 观察指标
1.3.1 mRNA表达的检测 用TRIzol（Invitrogen，美国）从培养的细胞中提取总RNA，测得RNA的浓度后，取1～2 μg的总RNA用逆转录试剂（TOYOBO，日本）合成cDNA。此cDNA为模板用实时荧光定量试剂盒（UltraSYBR Mixture，世纪康为）检测mdig的mRNA表达情况。实时荧光定量PCR反应体系20 μL：SYRB Green I MIX10 μL，前引物0.5 μL，后引物0.5 μL，cDNA1 μL，ddH2O 8 μL。使用ABI StepOne PlusPCR仪扩增，扩增条件为95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 15 s，循环40次。根据标准曲线，实时PCR仪计算机程序直接计算出检测基因表达量，以GAPDH为内参，正常胰腺导管上皮细胞H6c7为对照组，得出胰腺癌细胞的mdig基因相对表达量。PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列如下：mdig，前引物（5'-TGACCATCAGCACCTACC-3'）和后引物（3'-TCCTCCTCATTTCCCATC-5'）；GAPDH前引物（5'-TCTGACTT CAACAGCGACAC-3'）和后引物（5'-CAAATTCGTTG TCATACCAG-3'）；
1.3.2 蛋白表达的检测 细胞用RIPA裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）裂解提蛋白后，用BCA蛋白浓度测定盒（碧云天生物技术研究所）测浓度。用10% SDS-PAGE胶分离蛋白后转到NC膜上，再用兔抗人mdig（1∶1000，CST，美国）、Sox2（1∶1000，CST，美国）、GAPDH（Santa Cruz，美国）多克隆抗体孵育过夜，最后用羊抗兔二抗（1∶10 000，Lincoln，美国）孵育1 h。将膜取出漂洗，在膜上滴加适量ECL化学发光显色液，在凝胶成像系统中曝光。以GAPDH为内参，用Quantityone软件对各抗体条带灰度值进行统计分析计算出蛋白的相对表达量。
1.3.3 细胞增殖的检测 将转染后的胰腺癌细胞接种于96孔板中，并分别于第1天，第2天，第3天，第4天的同一时间点在96孔板中用加入10 uL CCK8试剂（日本同仁化学研究所），孵育2 h，用酶标仪测细胞450 nm的OD值。
1.3.4 细胞凋亡的检测 将转染后的细胞继续培养48 h后收集细胞，按照Annexin V-PE凋亡试剂盒（BD Bioscience，美国）说明书操作，加入试剂，避光孵育0.5 h后在流式细胞仪上检测两组胰腺癌细胞的凋亡情况。
1.4 统计学方法
用GraphPad Prism绘图，采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 midg在正常胰腺导管上皮细胞与两种胰腺癌细胞系中的表达
用Q-PCR法检测mdig基因在H6c7、PANC1及MIAPaCa2细胞中的mRNA表达水平，结果显示与正常胰腺导管上皮细胞H6c7相比，两种胰腺癌细胞PANC1及MIAPaCa2的mdig基因的mRNA表达水平均上调（P < 0.05）。Western-blot检测mdig基因的表达情况，结果与Q-PCR一致（P < 0.05）。见图1～2。
2.2 midg基因对胰腺癌细胞的促癌作用
用CCK8试剂检测细胞4 d内增殖情况的结果显示，与对照组相比，实验组的增殖率明显下降（P < 0.05）。
用Annexin V-PE凋亡试剂盒检测转染后的胰腺癌细胞的凋亡，结果显示，与对照组相比，实验组PANC1和MIAPaca2的凋亡率增高（P < 0.05）。见图3～4。
2.3 mdig对促癌基因Sox2的表达影响
与对照组相比，实验组mdig蛋白和Sox2蛋白的表达水平均下降（P < 0.05）。见图5。
3 讨论
胰腺癌因其早期诊断困难、恶性程度高、进展快、死亡率高而成为最具侵袭性肿瘤之一。与大多数肿瘤一样，胰腺癌的发生往往是多种基因共同作用的结果，而基因―环境之间的相互作用是促进癌症发生的一个重要因素[11]。
mdig是由465个氨基酸组成的分子量为53 kD的蛋白质，因结构中含有1个高度保守的JmjC结构域，所以mdig蛋白属于JmjC蛋白家族[5]。而JmjC蛋白家族具有组蛋白去甲基化酶活性，并参与肿瘤的发生发展[12]。此外，研究还发现mdig是c-myc的靶基因，它能够促进细胞增殖、迁移和转移[13-14]。mdig已经被证实在多种癌症中表达上调，且其在肿瘤组织的表达情况与肿瘤R床分期、分化程度等密切相关[15-17]。有研究发现，mdig基因在胃癌中高度表达，且能够促进胃癌细胞的增殖，抑制抑癌基因的表达[18]；mdig在肾癌中高度表达，并与差预后密切相关，mdig通过改变组蛋白H3的甲基化诱发肺癌的发生[19]。最近有研究指出，mdig能作为乳腺癌患者的重要预后因素且与患者生存时间密切相关。以上报道表明，mdig在肿瘤发生过程中发挥着重要作用，它可以作为肿瘤治疗的潜在靶基因。
本研究l现，mdig基因在胰腺癌细胞中表达上调，提示mdig可能在胰腺癌中发挥促癌作用。mdig能够增加胰腺癌细胞的增殖和抗凋亡能力，进一步说明mdig基因的上调可能与胰腺癌的发生密切相关。目前mdig参与肿瘤发生的机制仍不清楚。有研究发现在大多数食管癌以及肺癌组织中mdig的表达与c-myc的表达无相关性，表明mdig不仅受c-myc调控，还可能受其他因素的的影响而发挥促癌作用[18-20]。研究还发现，干扰mdig基因的表达后，原癌基因Sox2的表达也下调。Sox2是Sox基因家族的重要成员之一，与组织器官的形成和发展密切相关，能够维持干细胞特性，是诱导干细胞的关键转录因子[21]。Sox2也被认为是促进肿瘤形成和增殖的原癌基因，它在促增殖、抑制凋亡及分化上发挥着重要作用[22]，因此可以认为，mdig可能通过调控Sox2基因表达水平来发挥其促癌作用。
总之，随着对mdig基因在胰腺中发生发展的作用及其作用机制的深入研究，其很可能会成为新的胰腺癌生物治疗靶点，为今后胰腺癌的预防和治疗提供新的理论依据。
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