凋亡蛋白质的原核表达与纯化
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摘要：目的构建来自鸡贫血病毒（CAV，chicken anaemia virus）VP3基因编码的凋亡蛋白质表达载体，在大肠杆菌中进行表达，并研究凋亡蛋白质的纯化和稳定性。方法PCR（polymerase chain reaction）获得正确编码VP3基因片断，构建表达质粒pET-28a-VP3在E. coli BL21(DE3)中表达。用Ni-NTA柱纯化可溶性目标蛋白质，并研究不同条件下凋亡蛋白质的稳定性。结果目标蛋白质在大肠杆菌中获得表达，纯化后蛋白质纯度高于90 %，卡拉胶可明显提高重组蛋白质可溶状态下的稳定性。结论成功获得高纯度VP3可溶性蛋白质，增加了目标产物的稳定性，为进一步研究该蛋白质的临床应用奠定基础。
中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)03-0007-05
Expression, Purification and Activity Detection in vitro of Apoptin
FU Wen-bing1, SHI Xuan1, ZHAO Jian1*, FAN Li-qiang1, LI Su-xia, WANG Fu-jun2, SONG Yu-wen1, YUAN Qing-sheng1
(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. Zhejiang Rishengchang Pharmaceutical Co., Ltd, Zhejiang 322100, China)
Abstract ：Objective To construct an soluble expression system in E. coli for apoptin which was encoded by VP3 gene of chicken anemia virus (CAV), and study the purification and stabilization of apoptin. Methods The VP3 gene was amplified by PCR , then the segment was inserted into pET-28a (+) and the expression vector pET-28a-VP3 was constructed in E. coli BL21(DE3). The recombinant soluble protein was expressed in E. coli BL21(DE3)and purified by Ni-NTA column chromatography. The stability of apoptin was analyzed under different conditions. Results The target protein was expressed in E. coli BL21(DE3). The purity of apoptin was beyond 90 %after purification. The target protein was better stabilized by carrageenan in E.coli BL21(DE3). Conclusion Apoptin with high purity and stability can be successfully obtained, which do a base of the further study on clinic application of apoptin.
Key words：apoptin; prokaryotic expression; solubility; purification; stability
凋亡蛋白质是鸡贫血病毒（CAV）的VP3基因编码的小分子蛋白质，由121个氨基酸组成，含有2个脯氨酸富含区和2个碱性区，近N端（33～44a）含有一个11个氨基酸组成的核运输序列（NES），靠近C端（84～90，112～118）含有2个核定位序列（NLS）。
Noteborn等[1]研究揭示，凋亡蛋白质能够诱导人的肝癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等多种癌细胞的凋亡，以及转化细胞的凋亡，但对未转化的人双倍体细胞无损伤[2]。凋亡蛋白质的核定位可能是其诱发细胞凋亡的前提之一[3]。凋亡蛋白质选择性诱导肿瘤细胞的凋亡不同于通常的凋亡机制，它不是通过半胱天冬酶级联反应进行的，不需要p53参与，也不被bcl-2的过表达抑制，反而能被bcl-2所促进[4]。由于大部分肿瘤细胞具有p53突变或缺失，这种非p53依赖性使凋亡蛋白质作为抗肿瘤药物有很好的前景。
在许多关于凋亡蛋白质表达和纯化的研究中，凋亡蛋白质多以包涵体形式表达。本实验以pET-28a为载体进行凋亡蛋白质的原核表达，尝试不同的诱导条件及纯化方法，找到了可溶性目的蛋白质表达的条件，用金属螯合层析法直接纯化得到较高得率的活性目的蛋白质，并研究其稳定性。本研究对凋亡蛋白质作为肿瘤治疗药物应用于临床具有积极意义。
1材料和方法
1.1质粒、菌株和试剂
含有凋亡蛋白质全长基因的质粒pET-11a-VP3（浙江日升昌药业有限公司提供）；质粒pET-28a和菌株BL21(DE3)等（本实验室保存）；低相对分子质量蛋白质和DNA Mark（Sigma公司）；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）（BBI分装）；SDS（十二烷基磺酸钠）（Amresco分装）；限制性内切酶、T4-连接酶、Taq酶（MBI公司）；其它化学试剂均为国产分析纯。
1.2原核表达重组质粒的构建
VP3基因来源于pET-11a-VP3质粒。PCR引物分别为P1：5’-AATTTCAAC ATATGAACG CTCTCCAAG-3’；P2：5’- CGTCGGATCCTATT ACAGTCTTATACGC-3’。分别引入NdeI和BamHI位点。PCR产物经NdeI和BamHI双酶切后，回收的VP3基因片段与经同样双酶切的质粒pET-28a连接和转化。抽提质粒，用BamHI和NdeI对重组质粒进行双酶切鉴定得到阳性重组质粒。
1.3凋亡蛋白质的原核表达及纯化
1.3.1凋亡蛋白质的表达与鉴定将含有重组质粒pET-28a-VP3的BL21(DE3)菌株接种于LB培养基中，37 ℃培养过夜，次日按1∶100的比例稀释后放大培养，至一定菌体浓度时，加入适量IPTG诱导培养，离心收集菌体。
SDS-PAGE分析 12 % SDS-PAGE电泳，电压100 V，待样品即将进入分离胶时，调节至120 V。电泳后凝胶用考马斯亮蓝溶液（45 %甲醇，10 %乙酸，0.25 %考马斯亮蓝R 250）染色。
1.3.2可溶性目的蛋白质的纯化将新鲜菌体按1∶5（W∶V）的比例用Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，10 %甘油，pH 8.5）重悬，保持在冰浴中，超声破碎至菌液澄清。4 ℃，10 000×g离心20 min，取上清，Ni-NTA Agarose 金属亲和树脂（Qiagen公司）分离纯化。将上清液加入经Tris-HCl缓冲液平衡的Ni-NTA 介质中，4 ℃结合60 min。将混合物小心加入下端封闭的层析柱后，除去下端封盖，收集流出液（穿出峰）。以15 mL含20 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液漂洗后，再分别以15 mL含40，60，100，200 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白质。分别收集洗脱组分，进行SDS-PAGE鉴定，Bradford法测定蛋白质浓度，凝胶扫描软件分析纯度。
1.4凋亡蛋白质溶液稳定性研究
将重组表达的凋亡蛋白质于4 ℃放置3 d后，取样进行SDS-PAGE电泳鉴定，对照3 d前样品观察凋亡蛋白质在溶液状态中的稳定性。通过改变离子强度（增加NaCl浓度）和添加不同稳定剂来增加凋亡蛋白质的稳定性。
2结果
2.1重组表达质粒的构建
以pET-11a-VP3为模板扩增PCR，得到预期大小的目的片断。切胶回收后双酶切（BamHI＋NdeI），酶切产物与同样双酶切的pET28a连接。连接产物转化E.coli DH5α，用BamHI和NdeI双酶切鉴定重组质粒（见图1），得到了含有400 bp目的片段的阳性克隆，与预期结果相同。经上海生工生物公司测序验证构建好的pET-28a-VP3，序列正确，并使凋亡蛋白质的N端带有His-Tag，为目标蛋白质的纯化提供了条件。
2.2重组蛋白质的表达
为了提高重组蛋白质的表达量，本实验研究了IPTG的浓度。当菌体密度到达约A600 0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2，0.5，1 mmol/L，30 ℃诱导表达5 h，见图3。
由图3可见，经1 mmol/L IPTG诱导后表达量较高，目标蛋白质相对分子质量约16×103，与预期大小一致。
2.3可溶性凋亡蛋白质的纯化
诱导表达后菌体破碎离心，上清液用目的蛋白质N端的6×His咪唑基团与镍离子特异性结合，金属螯合层析法分离纯化，得到较纯的目的条带。经SDS-PAGE电泳扫描分析，纯度高于90 % ，见图4。蛋白质浓度测定表明每克湿菌体可以到0.49 mg凋亡蛋白质。
2.4凋亡蛋白质的稳定性研究
实验中发现凋亡蛋白质在溶液中不稳定，极易沉淀。实验中分别取IPTG诱导后样品立即进行SDS-PAGE分析，第3天再进行1次SDS-PAGE分析，见图5-A、5-B。
1. 低相对分子质量标准蛋白； 2，3. 放置2 d后目标蛋白质
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
图5 凋亡蛋白质SDS-PAGE稳定性分析
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE分析，可以看到目的蛋白质的表达条带清晰；2 d后SDS-PAGE分析，几乎观察不到目的蛋白质条带，推测凋亡蛋白质随着储存时间延长发生了聚合。这说明可溶性表达的凋亡蛋白质在溶液状态中易形成沉淀，一般2～3 d就发生大量聚集。因此有必要进行可溶性蛋白质的稳定性研究。
将表达得到的目的蛋白质分别保存于高、中、低3种不同盐浓度的缓冲液中，观察其稳定性。低盐溶液：20 mmol/L Tris.HCl缓冲液；中盐溶液：80 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl；高盐溶液：300 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl。pH值均为8.0。
实验表明，凋亡蛋白质在低盐溶液中不稳定，在超滤过程中即有大量沉淀析出。分别取高盐溶液和中盐溶液中4 ℃保存48 h前、后的样品，分析上清蛋白质浓度。2次重复实验结果表明，高盐蛋白质浓度平均降低16 %，中盐溶液中平均降低34 %。推测高盐环境更有利于凋亡蛋白质的稳定。
进一步研究，于缓冲液中加入各种稳定剂（最终浓度0.1 %）：阿拉伯树胶、卡拉胶、瓜豆尔胶、CMC（羧甲基纤维素钠）、明胶、高酯果胶、魔芋胶、黄原胶等，观察是否有利于重组凋亡蛋白质的稳定性。以上样品4 ℃保存7 d后离心得到的上清经SDS-PAGE分析，结果见图6。
1. 对照；2. 阿拉伯树胶；3. 卡拉胶；4. 瓜豆尔胶5.ＣMＣ；M. 低相对分子质量标准蛋白质；6. 明胶；7. 高酯果胶；8. 魔芋胶；9. 黄原胶
图6 添加剂对凋亡蛋白质稳定性的作用分析
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
实验结果表明，在高盐缓冲液中加入卡拉胶，目标蛋白质几乎没有沉淀，卡拉胶可以有效增强可溶性蛋白质的稳定性。
3讨论
本实验构建了表达质粒pET-28a-VP3，并在E. coli BL21(DE3) 中获得表达，用Ni-NTA柱纯化目标蛋白质。由于稀有密码子占VP3基因氨基酸序列组成的25 %左右，为了提高表达量，本实验选用严紧型表达宿主菌BL21(DE3)pLysS及促进富含稀有密码子的基因表达的Rosetta菌株表达目的蛋白质。实验结果（数据未列出）表明，Rosetta菌株中目的蛋白质的表达量并未增加，说明稀有密码子不是限制其表达量提高的因素。BL21(DE3)pLysS目的蛋白质的表达量也没有明显变化，表明目标产物对细胞无毒性或毒性很小。由于凋亡蛋白质稳定性差，其稳定性对于其临床应用至关重要。本实验通过改变溶液的离子强度及添加稳定剂来增加目标蛋白质的稳定性[5]，高盐缓冲液中加入卡拉胶可以有效增强凋亡蛋白质的稳定性[6]。本实验为在原核生物中进行目标蛋白质的表达和分离纯化，以及稳定性研究提供了简易可行的途径，为凋亡蛋白质的进一步药理研究奠定了基础。
参考文献
[1]Noteborn H M, Danen-van Oorschot A A, Vandereb A J. The apoptin gene of chicken anemia virus in the induction of apoptosis in human tumorigenic cells and in gene therapy of cancer[J]. In:Boulikas T. ed. Gene Ther Mol Biol. 1998: 399-406
[2]Danen-van Oorschot A A, Fisher D F, Grimbergen J M, et al. Apoptin induces apoptosis in human transformed and m alignant cells but not in normal cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5834.
[3]Zhang Y H, Abrahams P J, Vandereb A J, et al. The viral protein apoptin induces apoptosis in UV-C- irradiated cells from individuals with various hereditary cancer- prone syndromes[J]. Cancer Res, 1999, 59 (12): 3010-3015.
[4]Noteborn M H, Zhang Y H, Vandereb A J. Apoptin specifically causes apoptosis in tumor cell and after UV-treatment in untransformed cells from cancer-pron individuals: areview[J]. Mutat Res, 1998, 400(1-2): 447.
[5]Lilie H, Schwarz E, Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E.Coli[J]. Curr Opin Biotechnol, 1998, 9(5): 497-501.
[6]Xie Y, Wetlaufer D B. Control of aggregation in protein refolding: the temperature-leap tactic[J]. Protein Sci, 1996, 5(3): 517-523.