地黄生长期根叶中梓醇及总环烯醚萜苷含量变化
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摘要： 地黄主要活性成分为环烯醚萜苷，其中含量最高的是梓醇。该文主要对地黄生长发育过程中根叶所含总环烯醚萜苷和梓醇的含量变化进行研究。以地黄85-5为材料，于地黄不同生长期进行不同直径块根、不同叶龄的样品采集，分别采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定总环烯醚萜苷和梓醇的含量。研究结果表明，7―9月同一生长期地黄不同叶龄中总环烯醚萜苷和梓醇含量，幼嫩组织中含量较高，随着叶龄的增加而逐步下降；比较各生长期相同着生部位的叶片中梓醇和总环烯醚萜苷含量，大多数部位的叶片在10月达到最高；同一生长期块根直径越大，有效成分含量越高；梓醇含量同总环烯醚萜苷含量呈正相关。以期通过以上初步结论可以为地黄的萜类代谢调控研究和栽培技术提供参考依据。
关键词： 地黄；生长周期；梓醇；总环烯醚萜苷
[收稿日期] 2013-09-09
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81274014）
[通信作者] 李先恩，研究员，博士，Tel：（010）62810019，E-mail：
[作者简介] 吉雪琪，硕士研究生，E-mail：
地黄Rehmannia glutinosa Libosh，为玄参科多年生草本植物，是著名的“四大怀药”之一，具有滋阴清热、补血止血等功效[1]。与人参、栝楼、葛根共称为中药治疗消渴病之四大“圣药”[2]。环烯醚萜苷类物质是地黄中的主要活性成分。梓醇是地黄中含量最高的环烯醚萜苷[3]，其多种生物活性已得到实验验证。研究表明，梓醇对脑缺血损伤、老年痴呆、帕金森、糖尿病及其并发症均有一定的治疗和预防作用[4-7]。
有关地黄中总环烯醚萜苷含量变化的研究尚未见报道，梓醇积累规律的研究已有不少报道[8-12]。与前人研究不同的是本研究首次将研究对象细化，测定不同生长时期地黄不同直径块根、不同叶龄中总环烯醚萜苷和梓醇含量，全面探讨地黄有效成分的分布和变化规律，为萜类次生代谢产物积累的研究奠定一定的理论基础。
1 材料
地黄为主栽品种温85-5，于2012年4月16在中国医学科学院药用植物研究所试验田种植。种植土壤类型为壤土，种植密度为 40 cm×40 cm，按常规方法进行田间管理。2012年7月19日，8月13日，9月13日，10月15日采样，共4次。每次随机采集地黄植株25株左右，采集时选择长势基本相同的植株（出芽时标记）。叶片按照叶龄划分，最幼嫩部分标记为叶-1，依次类推为叶-2～叶-8；块根按照直径分为粗、中、细，具体数值见表1。采集样品经液氮速冻后，保存于-80 ℃冰箱。
UV-752紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司），Waters 600E高效液相色谱仪（2487紫外检测器，2707自动进样器），CBL Model 100型柱温箱（Photoelectyon Technology 公司），Empower2色谱工作站，1/1万天平（上海仪器厂），1/10万天平（METTLER TOLEDO，梅特勒-托利多），超声波清洗机TP300（天鹏电子新技术背景有限公司），电热恒温鼓风干燥机（上海精密实验设备有限公司）。梓醇（批号20121114）对照品购自天津一方科技有限公司，纯度98%以上；乙腈（色谱纯，Honey Well公司），水为娃哈哈纯净水，2，4-二硝基苯肼（西亚试剂），其他试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 含水量测定
精密称取不同叶龄、不同根径样品5 g左右，参照2010年版《中国药典》一部附录Ⅸ H 水分测定法第一法，测定含水量。
2.2 总环烯醚萜苷含量测定
2.2.1 测定方法 采用分光光度法[13]，精确吸取1.0 mL反应液加入1 mol・L-1盐酸溶液2 mL，摇匀，90 ℃水浴反应15 min，室温静置15 min放冷，加二硝基苯肼乙醇溶液0.5 mL，摇匀，90 ℃水浴反应25 min，室温静置15 min放冷，再加入1 mol・L-1 NaOH 70%乙醇溶液3 mL，摇匀终止反应，室温静置1.5 h。以70%乙醇为空白对照，在462 nm处测定吸光度。
2.2.2 对照品溶液的制备及标准曲线 精密称取梓醇对照品5.35 mg以70%乙醇定容至25 mL量瓶，摇匀，制成每1 mL中含241 μg梓醇的对照品溶液。分别精密吸取梓醇对照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL入10 mL量瓶中，加入70%乙醇定容。按照方法2.2.1所述，以70%乙醇反应为空白在462 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y= 0.008 1x+0.010 1，R2=0.999 5。
2.2.3 供试品溶液的制备 取新鲜地黄组织（叶片剪碎为宽度3 mm，根切片厚度2 mm）约2.5 g左右，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%乙醇25 mL，超声1 h，过滤得提取液，于滤渣中再加入70%乙醇25 mL，超声30 min，过滤得提取液。将2次超声所得滤液合并，定容至50 mL，精密吸取10 mL提取液用于样品总环烯醚萜苷含量测定，余下40 mL用于梓醇含量测定。提取液通过0.45 um滤膜，精密吸取1.0 mL，定容至10 mL，取1.0 mL用于显色反应。
2.3 梓醇含量测定
2.3.1 测定方法 参照2010年版《中国药典》中梓醇HPLC测定条件，试验中发现未加0.1%磷酸的水相与加入0.1%磷酸的水相出峰效果一致，所以采用乙腈-水（1∶99）作为流动相； phenomenex Hydro_RP（4.6 mm×250 mm，4 μm）色谱柱，柱温30 ℃；流速1 mL・min-1；检测波长210 nm。理论塔板数按梓醇峰面积计算均不低于5 000。
2.3.2 对照品溶液的制备及标准曲线 精密称取梓醇对照品4.17 mg，加纯净水配置成每1 mL中含1 024 μg梓醇的对照品为贮备溶液。分别进样对照品溶液1，2，4，5，6，8，10 μL，以峰面积积分值对数为纵坐标，对照品进样量（μg）对数为横坐标制定标准曲线，得回归方程y= 1.113 2x+5.259 9，R2=0.999 9。
2.3.3 供试品溶液的制备 将剩余40 mL超声提取液浓缩至近干，用流动相溶解，转移至25 mL量瓶中定容，摇匀，HPLC测定前用0.45 μm滤膜过滤。
3 结果
3.1 地黄生长期根叶含水量变化
同一生长期，不同叶龄叶片的含水量表现为幼嫩部分含水量较高，至成熟叶片逐渐降低，衰老叶片中含水量升高一些的凹状变化，见图1；采集于同一部位的叶片含水量在不同生长期的比较表明随着生长期的增加其含水量逐步降低，7月份各叶龄叶片中含水量显著高于其他时期；同一生长期采集的不同直径块根，含水量同根直径成正比。
图1 地黄生长期根叶含水量变化
Fig.1 Water content of Rehmannia glutinosa in leaves and roots during the growth period
3.2 地黄生长期根叶总环烯醚萜苷含量变化
7―9月各生长期，不同叶龄中总环烯醚萜苷含量变化趋势为，幼嫩叶片中含量高，随着叶龄的增长总环烯醚萜苷含量逐步下降，见图2。而在10月份成熟叶片中总环烯醚萜苷含量增加，同幼嫩部分无较大区别，衰老叶片中含量较低。
采集自同一部位的叶片，除叶-1、叶-2在10月总环烯醚萜苷含量降低外，其余叶片部分均随着生长期的增加总环烯醚萜苷含量不断提高，在10月达到最高，见图3。
同时期的地黄块根，根直径越大，总环烯醚萜苷含量越高。不同时期块根除9月粗根总环烯醚萜苷含量显著高于各时期块根外，基本上总环烯醚萜苷含量还是同直径呈正比，见图4。
图2 地黄生长期不同叶龄总环烯醚萜苷含量变化
Fig.2 Total iridoid glycoside content of Rehmannia glutinosa in different ages of leaves from July to October
图3 同一部位叶片在各生长期总环烯醚萜苷含量变化
Fig.3 Total iridoid glycoside content of Rehmannia glutinosa in leaves on the same site during the growth period
图4 各生长期不同直径块根中总环烯醚萜苷含量
Fig.4 Total iridoid glycoside content in different diameter of Rehmannia glutinosa tuberous roots at different stages
3.3 地黄生长期根叶梓醇含量变化
7―9月各生长期，不同叶龄梓醇含量变化趋势同总环烯醚萜苷含量变化趋势一致，也是幼嫩部分较高，而后随着叶龄增长逐步下降，见图5。但是在生长末期10月，地黄幼嫩叶片中梓醇含量下降，而成熟叶片含量明显提高。
采集于同一部位的叶片在各个时期梓醇含量变化趋势同总环烯醚萜苷变化趋势有较大不同。叶-
图5 地黄生长期不同叶龄梓醇含量变化
Fig.5 Catalpol content of Rehmannia glutinosa in different ages of leaves from July to October1、叶-2在8月明显高于其他时期，叶-8在9月份较高，其余不同叶龄叶片在7―9月各时期梓醇含量均没有明显差异，但10月份显著高于其他时期，见图6。
图6 同一部位叶片在各生长期梓醇含量变化
Fig.6 Catalpol content of Rehmannia glutinosa in leaves on the same site during the growth period 采自同时期的地黄块根，基本是根直径越大，梓醇含量越高。不同时期块根梓醇含量与根直径联系无规律可寻，10月块根梓醇含量高于其他时期，但直径最大块根的梓醇含量不是最高，见图7。
图7 各生长期不同直径块根中梓醇含量
Fig.7 Catalpol content in different diameter of Rehmannia glutinosa tuberous roots at different stages
利用统计学软件对7―10月各生长期中不同组织的梓醇含量和总环烯醚萜苷含量进行相关分析，分析结果显示两变量在0.05水平极显著相关，各生长期的相关系数分别为0.931，0.938，0.826，0.810。
4 讨论
由于梓醇和其他环烯醚萜类物质稳定性较差，干燥后再进行含量测定会较新鲜样品损失一半以上，遂本研究采集鲜地黄进行有效成分含量测定，同时测定含水量，换算为干重计算梓醇含量，更为实际反应地黄根叶中有效成分含量。
地黄叶片部分含水量的变化趋势提示，7月地黄各组织含水量要显著高于其他各时期，而不是8月含水量最高，与匡岩巍等的研究结果不一致。推测2012年地黄生长旺盛期应在7月。
关于地黄根叶中总环烯醚萜苷含量变化的研究还是首次。从总环烯醚萜苷在根叶中含量变化趋势来看，是一个逐渐积累的过程，7―9月增加速度较快，9―10月期间增速放缓含量达到最高。在不同叶龄中，7―9月为幼嫩组织中含量较高，10月份为成熟组织中含量较高，推测可能同地黄生长环境改变有一定关系。
同一生长期各叶龄中梓醇含量变化与总环烯醚萜苷含量变化一致，新生的幼嫩叶片中含量较高，梓醇含量的这一变化规律与Gretchen K等[15]对车前属植物不同叶龄叶片中梓醇含量变化的研究结果一致。通常来说，叶龄大的叶片有效成分含量积累应较高，而幼嫩叶片含量较高这可能与梓醇作为一种防御性次生代谢产物有关系。统观地黄叶片中梓醇含量变化，与前人的结果有一致之处也有不同的地方。地黄大部分叶龄组织在7―9月梓醇含量差异不显著，这与解军波等的研究结果相似，10月成熟叶片中梓醇含量明显高于其他各时期，这与王太霞等和曾令峰等的研究结果类似，10月梓醇含量较高推测可能是气温环境发生较大变化而导致的。
同一生长期，直径大的块根梓醇含量较高，这同本实验室之前的研究结果[14]一致，块根中总环烯醚萜苷含量变化也遵循此规律。10月块根中，根直径最大的块根梓醇含量虽然不是最高，但总环烯醚萜苷含量仍高于其他直径较小的块根，这表明块根中梓醇有可能在后期转化为其他环烯醚萜苷类物质。
地黄各生长期根叶中梓醇含量同总环烯醚萜苷含量高度的相关性表明，通过提高总环烯醚萜苷含量很有可能提高梓醇含量，这为研究地黄萜类物质代谢奠定了一定的理论基础。
同前人研究结果类似，本研究也发现，地黄叶片部分的梓醇和总环烯醚萜苷含量并不低于块根中的含量，甚至在有些叶部位要明显高于根部，这表明地黄叶片可作为梓醇的重要来源以缓解地黄资源短缺的局面，具有重要的现实意义。
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Study on distribution and dynamic accumulation of catalpol and
total iridoid in fresh Rehmannia glutinosa
JI Xue-qi， SUN Peng， QI Jian-jun， LIAO Deng-qun ， LI Xian-en*
（Institute of Medicinal Plants Development， Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medical college， Beijing 100193， China）
[Abstract] Iridoid glycosides were the main active ingredient of Rehmannia glutinosa， of which catalpol has the highest content. This work will provide theoretical basis for metabolic study and cultivation of iridoids on the basis of the dynamic accumulation of catalpol and total iridoids in the growth of R. glutinosa. The samples of rehmannia 85-5 were gathered in the same filed from July to October. The contents of catalpol and total iridoid glycosides were measured by HPLC and specteophotometric， respectively. The results showed that youngest leaves had the higher content of catalpol and total iridoid glyosides than that of the other two leaf ages in the same growth stage from July to September， while their content of catalpol and total iridoid glycosides were all decreased as the growth of leaves of R. glutinosa. The content of catalpol didn′t differ significantly from July to September， whereas it has significantly increased in October in the three leaf stage. In the same stage， the wider the root diameter is， the higher content of the effective components are. In August and September， the total iridoid glycosides have the fastest accumulation. The content of catalpol was increased as the accumulation of total iridoid glycosides.
[Key words] Rehmannia glutinosa； growth cycle； catalpol； total iridoid
doi：10.4268/cjcmm20140320