体积排阻高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法测定海产贝类中镉的形态
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摘 要 [HTSS]运用体积排阻高效液相色谱电感耦合等离子体质谱联用技术（SECHPLCICPMS）分析了高镉积累扇贝和低镉积累菲律宾蛤仔中镉的存在形态，并结合体外全仿生消化技术，研究了在唾液、胃、肠无机物和有机物（含消化酶）作用下，扇贝和菲律宾蛤仔中镉的主要存在形态。结果发现：扇贝中Cd总量约为菲律宾蛤仔的10倍；在扇贝中检测到3种Cd形态：金属硫蛋白（MT）Cd、谷胱甘肽（GSH）Cd和半胱氨酸（Cys）Cd；在菲律宾蛤仔中检测到2种Cd形态：MTCd和GSHCd；以峰面积作参考进行比较，扇贝中MTCd和GSHCd含量分别约为菲律宾蛤仔的5.6和2.0倍。结合体外全仿生模型发现，在扇贝胃全仿生提取液中，检测到1种未知小分子有机镉形态（CdX），在扇贝肠全仿生提取液中检测到4种Cd形态，其中MTCd是主要形态；而在菲律宾蛤仔胃、肠全仿生提取液中均仅检测到1种未知小分子有机态镉（CdX）。本实验证明贝类中的MTCd， GSHCd， CysCd中络合的Cd在生物体胃肠消化液作用下会发生解离。
[KH*3/4D][HTH]关键词 [HTSS]镉； 形态分析； 体积排阻高效液相色谱； 电感耦合等离子体质谱； 体外全仿生消化
[HT][HK]
[FQ（3２,X,DY－Ｗ][CD15] 20110903收稿；20111029接受
本文系国家自然科学基金（No.30371103）和中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金（No.2010t912）资助
Email: shangdr@ysfri.省略
[HT]
1 引 言
镉（Cd）是一种有毒重金属，被美国毒物管理委员会（ATSDR）列为第六位危害人体健康的有毒物质。Cd在正常环境中含量很低，但水生生物对Cd的富集能力极强，如鱼类可富集103～105倍，贝类可富集105～106倍\[1\]。因此，Cd已成为影响水产品食用安全的重要因素之一。最近连续几年对我国贝类进行的质量安全普查发现，不同贝类体内Cd含量差异很大，尤其以扇贝中Cd含量最高，超标现象最为严重。而菲律宾蛤仔中Cd含量很低，前者约为后者的10倍, 甚至更高。Cd在生物体中以多种形态存在，不同形态Cd具有不同的生物学毒性，因此准确测定贝类中Cd的主要存在形态具有重要意义。
色谱与原子光谱、质谱联用是元素形态分析的主要技术手段。如HPLC与电感耦合等离子体质谱（ICPMS）\[2,3\]、电喷雾串联质谱（ESIMS/MS）\[4～6\]、飞行时间等离子体质谱（ICPTOFMS）\[7\]等联用，分析生物体中Cd的形态。体积排阻色谱分离（SECHPLC）与ICPMS联用技术同时具有交联葡聚糖（Sephadex G50）分子筛凝胶过滤层析的根据分子量分离化合物的优点和ICPMS灵敏的多元素同时检测优点。又因为其流动相一般采用中性的TrisHCl/NaCl缓冲液，与生物体本身条件相似，因此可以较准确地反应蛋白质以及其它巯基化合物在生物体内与元素的结合状况\[8,9\]。Wei等\[10\]运用SECHPLCICPMS联用分析了长穗偃麦草Agropyron elongatum中的Cu, Zn和Cd的形态；杨红霞等\[11\]运用SECHPLCICPMS联用分析了印度芥菜中镉的形态，证明Cd以植物螯合肽（PC）3 Cd、植物螯合肽（PC）2 Cd、谷胱甘肽（GSH）Cd，及半胱胺酸（Cys）Cd 4种形态存在。
虽然扇贝中Cd超标现象严重，但是目前尚无因食用扇贝而引发镉中毒的报道。因此，研究在生物体的胃肠消化液作用下贝类中Cd的存在形态，对评估贝类中Cd的食用安全性具有积极意义。“全仿生消化”法即模拟人体消化环境，加入消化液所含无机物和有机物（包括消化酶），探讨贝类中Cd在人体消化液作用后的主要存在形态。与动物模型相比，体外全仿生消化技术评价贝类中镉形态变化更可靠、简便、易行。本研究以栉孔扇贝（Chlamys farreri）和菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）为研究对象，采用SECHPLCICPMS联用技术对扇贝和菲律宾蛤仔内Cd的主要存在形态进行分析，并运用体外全仿生消化模型，研究在胃肠全仿生消化液作用下2种贝类中Cd的主要存在形态以及形态之间的转化。2 实验部分
2.1 仪器与试剂
ELANDRC Ⅱ电感耦合等离子体质谱（ICPMS，PerkinElmer公司），工作参数为：射频功率 1150 W，等离子体气流速 15 L/min，辅助气流速1.2 L/min；采样时间1800 s。Series 200 高效液相色谱（HPLC，PerkinElmer公司），分离条件：TSKGEL G3000分离柱及TSKGELTMPWgruard Column保护柱，流速：0.8 mL/min，进样量80
SymbolmA@ L，自动进样。通过Chromera软件控制的触发接口电缆，以达到自动控制HPLC泵、自动进样器与ICPMS联用，仪器自动积分，以峰面积计算含量；AA600石墨炉原子吸收仪（PerkinElmer公司）； SHY2A 型水浴恒温振荡器（江苏金城国胜实验仪器公司）；S40K型pH计（梅特勒托利多仪器公司）；LNK872型多功能快速消化器（江苏省宜兴市科教仪器研究所）。超纯水系统（MilliQ element A10, Millipore）。
标准溶液配制参照文献\[11\]：在氮气保护下配制CysCd及GSHCd标准溶液，用于确定色谱峰保留时间。流动相配制：10 mmol/L TrisHCl缓冲液，其中加入0.1 mol/L NaCl和0.03% NaN3，调节pH=7.5，0.45
SymbolmA@ m滤膜过滤，超声40 min除去溶解氧。
2.2 样品处理
分别称取约2.5 g扇贝和菲律宾蛤仔样品，加入两倍体积经4 ℃预冷的10 mmol/L pH 7.5的TrisHCl缓冲液匀浆，4 ℃静置过夜，取匀浆液于4 ℃，以10000 r/min离心20 min，取上清液，0.45
SymbolmA@ m滤膜过滤后上机分析。
2.3 胃和肠全仿生消化液制备
参考文献\[12,13\]，制备胃和肠全仿生消化液。分别加入胃和肠中所含的有机物和无机物，调pH值至各消化液对应的pH值，分别加入相应消化酶，制备胃和肠全仿生消化液。具体配制方法见文献\[13\]。
分 析 化 学第40卷
第5期赵艳芳等： 体积排阻高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法测定海产贝类中镉的形态
2.4 扇贝和菲律宾蛤仔全仿生提取液制备
将扇贝、菲律宾蛤仔用超纯水冲洗至少3遍后，蒸熟，去壳后匀浆；称取约5.0 g样品，加入全仿生唾液10 mL，在37 ℃下恒温振荡5 min；加胃液150 mL，在37 ℃下恒温振荡2 h；从胃仿生消化食糜中取100 mL，于4 ℃以8000 r/min离心10 min，取上清液用0.45
SymbolmA@ m滤膜抽滤，得胃全仿生提取液。在余下的胃仿生消化食糜中加十二指肠液200 mL和胆汁80 mL，在37 ℃下恒温振荡7 h；取肠仿生消化食糜100 mL，于4 ℃以8000 r/min离心10 min，取上清液用0.45
SymbolmA@ m滤膜抽滤，得肠全仿生提取液。胃和肠的全仿生提取液于4 ℃下保存待用。
2.5 扇贝和菲律宾蛤仔中总Cd含量检测
准确称取5.0 g样品于100 mL消化管中，分别加入15 mL HNO3和5.5 mL HClO4浸泡12 h，用多功能快速消化器消化， 同时做试剂空白对照，总Cd采用石墨炉原子吸收测定。3 结果与讨论
3.1 扇贝和菲律宾蛤仔中总Cd含量
实验测得扇贝中总Cd含量为4.87 mg/kg，菲律宾蛤仔中总Cd含量为0.48 mg/kg，前者约为后者的10倍。已有研究表明，扇贝具有高耐受、高积累Cd的特性\[14,15\]。但是，目前未见因食用扇贝而导致Cd中毒的报道。因此，仅检测分析贝类中Cd的总量并不能准确对贝类中Cd的食用安全性进行风险评估。
3.2 扇贝和菲律宾蛤仔中Cd形态分析
[TS（][HT5”SS] 图1 Cd形态标准溶液的色谱图
Fig．1 Chromatograms of Cd standard solutions[HT][TS）]
在扇贝组织中主要检测到3个未知峰，出峰时间分别为7.6，10.5和13.5 min。根据半胱氨酸（Cys）Cd、谷胱甘肽（GSH）Cd标准物质保留时间（图1）及文献\[11,16\]报道的分子量范围，初步判断13.5 min处为半胱氨酸（Cys）Cd，10.5 min为谷胱甘肽（GSH）Cd，7.6 min为金属硫蛋白（MT）Cd。因此，扇贝中的Cd主要以MTCd，GSHCd和CysCd 3种形态存在（图2a）。在菲律宾蛤仔中主要检测到2种Cd形态峰，[TS（][HT5”SS] 图2 扇贝（a）和菲律宾蛤仔（b）中镉形态分离色谱图
Fig．2 Chromatograms of Cd species in Chlamys ferreri （C. farreri） （a） and Ruditapes. Philippinarum （R. philippinarum） （b） by SECHPLCICPMS[HT][TS）]分别为MTCd和GSHCd（图2b）。
由于目前国内外均无标准的有机Cd标准物质进行定量，只能以峰面积比较2种贝类中有机Cd的含量分析，2种贝类中主要Cd形态的含量见表1。由此可见，两种贝类组织内Cd的存在形态具有一定差异。结合样品的质量，计算出扇贝中MTCd的含量约为菲律宾蛤仔的5.6倍，扇贝中GSHCd的含量
[HT5”SS][*4]表1 扇贝和菲律宾蛤仔中主要Cd形态含量（以峰面积比较）
Table 1 The main Cd species in C. farreri and R. philippinarum （according to the peak area）
[HT6SS][BG（][BHDFG2,WK10,WK6\.3W]MTCd
GSHCdCysCd扇贝 C. farreri65449
5130140958
菲律宾蛤仔
R. philippinarum1336128280[BHDFG２,WKZQ0W] MT: Metallothionein; GSH: Glutathione; Cys: Cystein.[BG）W][HT][]
约为菲律宾蛤仔的2.0倍。
已有研究表明，Cd在海洋双壳贝类体内主要以MTCd的形式存在\[17\]。本研究通过形态分析证明， Cd在贝类组织中以MTCd，GSHCd和CysCd等主要形态存在。MT是广泛存在于动物各类组织、器官中的功能性结合蛋白，在机体微量元素代谢平衡、重金属解毒、清除自由基等方面具有重要作用\[1\]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，广泛存在于生物体中，具有非常重要的整合解毒作用\[19\]。MT和GSH通过半胱氨酸上的巯基，能与金属离子（M2＋）结合，形成无毒或低毒的配合物而排出体外，从而起到解毒的作用。因此Cd在扇贝和菲律宾蛤仔中均主要以与MT, GSH和Cys的络合态存在，降低了Cd对生物体的危害。
3.3 全仿生消化作用下扇贝和菲律宾蛤仔中Cd形态分析
运用体外全仿生消化模型，分析在生物体胃和肠消化液作用下，扇贝和菲律宾蛤仔中Cd的主要存在形态及不同形态之间的转化，可以为准确评估扇贝和菲律宾蛤仔的食用安全性提供重要依据。
从图3a可见，在扇贝胃全仿生提取液中检测到1种未知峰，出峰时间为18.5 min，为小分子有机镉，定为CdX。图3b是在肠全仿生消化液作用后，扇贝中Cd的主要存在形态，共检测到4种有机态镉峰，其中主要是MTCd，根据保留时间可以判定其余3种均是小分子有机镉。但对于菲律宾蛤仔，在胃和肠全仿生消化液作用下，Cd的主要形态均为小分子有机镉（CdX）（图4）。
[TS（][HT5”SS] 图3 扇贝胃全仿生提取液（a）和肠全仿生提取液（b）中镉形态分离色谱图
Fig．3 Chromatograms of Cd species in wholebionic digestion of gastric extracts （a） and wholebionic digestion of intestine extracts （b） for C. farreri by SECHPLCICPMS[HT][TS）]
[TS（][HT5”SS] 图4 菲律宾蛤仔胃全仿生提取液（a）和肠全仿生提取液（b）中镉形态分离色谱图
Fig．4 Chromatograms of Cd species in wholebionic digestion of gastric extracts （a） and wholebionic digestion of intestine extracts （b） for R. philippinarum by using SECHPLCICPMS[HT][TS）]
在胃全仿生提取液中，两种贝类的主要Cd形态相似，且菲律宾蛤仔中小分子有机镉（CdX）的浓度高于扇贝（以峰面积做参考）。但是，在肠消化液作用下，扇贝和菲律宾蛤仔中Cd的主要形态存在很大差异。扇贝肠全仿生提取液中发现3种小分子有机镉，MTCd是肠消化液中的主要存在形态，可以推断在唾液、胃、肠中无机及有机物（包括消化酶）作用下，扇贝中的GSHCd，CysCd中络合的Cd发生解离，Cd与未知的分子量很小的有机物结合。菲律宾蛤仔全仿生消化实验发现， 胃和肠消化液中的Cd均为分子量很小的有机镉（CdX），说明MTCd中的Cd在胃肠消化液作用下发生解离。通过全仿生消化实验可以得出， 贝类中MTCd， GSHCd和CysCd中络合的Cd在胃肠消化液作用下会发生解离；同时证明，未知小分子有机镉（CdX）是消化液中主要的Cd形态之一，而目前关于小分子有机镉（CdX）研究还很少，有关其结构、形态及其代谢动力学特性需要进一步研究。
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Speciation Analysis of Cadmium in Marine Bivalves by
Size Exclusion ChromatographyHigh Performance
Liquid ChromatographyInductively Coupled
Plasma Mass Spectrometry
ZHAO YanFang, SHANG DeRong*, NING JinSong, ZHAI YuXiu
（Yellow Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences,
The National Center for Quality Supervision and Test of Aquatic products,
Key Laboratory of Test and Evaluation on Quality and Safety of Aquatic Products,
Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China）
Abstract The speciation analysis of cadmium in the scallop （Chlamys farreri, C. farreri） with high Cd accumulation capability and the clam （Ruditapes philippinarum, R. philippinarum） with low Cd accumulation capability was first conducted by size exclusion chromatographyhigh performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometry （SECHPLCICPMS）, and in vitro wholebionic digestion model was used to determine the cadmium speciation in two bivalves under the action of saliva, the acidity of stomach and intestine with inorganic and organic components and digestion enzymes. The results showed that the total cadmium content in C. farreri was almost 10 times in R. philippinarum. Three Cd species, metallothionein （MT）Cd, glutathione （GSH）Cd and cystein（Cys）Cd were detected in C. farreri, and two Cd species, MTCd and GSHCd were detected in R. philippinarum. According to the different peak areas, MTCd and GSHCd content in C. farreri was about 5.6 and 2.0 times of those in R. philippinarum respectively. Using in vitro wholebionic digestion model, one unknown Cd species with small molecule （named CdX） was detected in wholebionic digestion of gastric extracts, and four Cd species （mainly MTCd） were detected in the wholebionic digestion of intestine extracts for C. farreri; however, for R. philippinarum, the unknown CdX was the main Cd species in both gastric and intestinal extracts. The experiment also proves that Cd can be separated from MTCd, GSHCd and CysCd under the effect of the wholebionic digestion of stomach and intestine.
Keywords Cadmium; Speciation analysis; Size exclusion chromatographyhigh performance liquid chromatography; Iinductively coupled plasma mass spectrometry; In vitro wholebionic digestion
（Received 3 September 2011; accepted 29 October 2011）
天瑞仪器成功推出三款质谱仪新品
近日，由天瑞仪器自主研发的三款质谱仪新品（GCMS 6800气相色谱质谱联用仪、ICPMS 2000电感耦合等离子体质谱仪、LCMS 1000液相色谱质谱联用仪）已完成技术攻关、整机优化、性能参数考核、稳定性测试、专家评审、媒体等工作，市场推广正式展开。
三款质谱仪新品的多项软硬件设备均填补了国内空白。ICPMS 2000电感耦合等离子体质谱仪属于无机质谱，作为国内首台电感耦合等离子体质谱仪，具有高灵敏度，宽动态范围，多元素检测等优势。仪器采用了离子离轴透镜系统，六极杆聚焦系统，27.12MHz固态发生器，2.0MHz四极杆射频电源，气体流量集成控制模块等创新技术。
GCMS 6800气相色谱质谱联用仪和LCMS 1000液相色谱质谱联用仪属于有机质谱，分别针对挥发性强，热稳定性差和不易挥发，热稳定性强的中小分子物质。GCMS 6800融入了带电子压力控制（EPC）、电子流量控制（EFC）的气相色谱、双灯丝EI源、带预四极杆质量分析器、带高能转换打拿极的电子倍增器等创新技术。LCMS 1000离子源设计采用独特的气路方式，并融入自主研发的六极杆电源，四极杆电源，离子源加热模块，信号采集与处理，控制电路，多路高压直流电源等，有效改善低质量数元素检出限。
据悉，质谱分析技术是当代最高端的分析技术之一，在食品、环境、人类健康、药物、国家安全等领域具有重要作用。但日渐繁荣的国内质谱仪市场，却长期主要依赖进口。目前国内质谱仪器市场几乎完全为国外产品垄断。天瑞仪器历时5年的潜心研发，推出三款质谱仪系列新品，对国产仪器在高端分析检测领域实现新突破，具有重要意义。