镉饱和法对大鼠肝脏和血浆金属硫蛋白测定方法研究

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摘要 目的：探索镉（Cd）饱和法测定大鼠肝脏和血液金属硫蛋白（Metallothionein，MT）的条件。方法：建立镉饱和法测定MT加血红蛋白的沉降次数；镉饱和法测定MT的标准曲线；镉饱和法测定MT的精确度；测定大鼠血浆和肝脏MT含量。结果： Cd饱和法在测定过程中，加血红蛋白后的最佳沉降次数为3次。对两组同一样品分别进行5次测定，其变异系数分别为4.86%和0.95%。用已知浓度MT溶液作精密度实验，可见线性关系（r=0.9991，p

关键词 镉饱和法 大鼠肝脏 金属硫蛋白

金属硫蛋白（Metallothionein，简称MT）是一类广泛存在于生物体内的低分子量（约6000～7000道尔顿）、富含半胱氨酸、缺少环状氨基酸的金属结合蛋白，每摩尔MT可以结合6～12个Zn、Cd、Cu、Hg和Ag等重金属[1] [6]。结合了二价金属镉离子的MT在250nm处有特殊的光吸收峰[2]。金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢，具有拮抗电离辐射、清除自由基以及重金属解毒的作用，还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关[3]。现在测定MT的方法较多，有镉/血红蛋白亲和分析法（简称镉饱和法）[4]、银饱和法、电化学法、免疫法、色谱分析法、蛋白质印迹分析法、巯基显色法和偶联技术等[3-4]。其中镉饱和法无需特殊的试剂和设备，而且周期短、消耗少，比较适合大量研究使用[4]。本研究通过镉饱和法测定大鼠肝和血中的金属硫蛋白，有简便、快速、不用同位素镉，灵敏度较好的优点。

1.材料及方法

1.1 主要仪器及试剂

1.1.1仪器：10ml离心管数支；容量瓶100ml，250ml，500ml；移液器50-200?l，200-1000?l；旋涡混匀器，型号QC-901，江苏海门市麒麟医用仪器厂；电热恒温水箱；DY89-I型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研所；LD5-2A型离心机，5000r/min，北京医用离心机厂；GF95原子吸收分光光度计光谱仪。

1.2 实验动物

选用健康雌性SD大鼠40只，大鼠合格号SCSK（川）2004-15，体重约250～300g，标准饲料喂养，每日用针筒灌喂一次，未接触重金属，取标本时34只一般状况良好，6只在喂养期间死亡。采眼球血及肝脏备用。

1.3 样品预处理

1.3.1 取大鼠肝脏数克置于匀浆管，加4倍tris-HCl缓冲溶液，在匀浆机上匀浆数分钟，待匀浆完成后，将匀浆液倒入离心管中，10000r/min离心20分钟，取上清液备用。

1.3.2 将取得的大鼠血在3000r/min离心机上离心8min，取上清液备用。

1.4 MT的测定方法

1.4.1 测定原理：本方法原理基于MT与二价镉离子结合后，很难被其他金属置换下来，且使Cd-MT发生50%解离的pH值为2.5～3.5[5]。因此本法在加入CdCl2溶液后，用pH=8的Tris-HCl缓冲液调节PH值，使二价镉离子充分与MT结合后，剩余的游离镉用牛血红蛋白结合，经加热离心而沉淀下来，再测定与MT结合的金属镉的量。后根据每分子Cd与3个巯基结合，即一分子MT和6分子镉结合，计算MT的含量。

1.4.5 数据处理 数据采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。

2. 结果

2.1 最佳离心次数的确定

在1.4.2操作步骤中，进行②步骤2～5次，其结果见表1。表1的数据表明，离心3次后上清液中Cd含量明显低于2次离心后，差异明显（P0.05，说明离心3次与4、5次相比，结果无差异。因此认为，经过离心3次后，游离镉基本被除去，实验选择离心三次为最佳。

2.2 金属硫蛋白的标准曲线

2.3 回收实验

分别取同一只预处理过的大鼠血液（0.5ml）置于6支试管中，按表3分别加入一定量的标准MT，并按上述方法处理，进行MT测定的回收实验，由表3所示结果可见标准MT回收率范围为：97.2～104.3%，表明该方法具有较好的重复性。

2.4 精密度检验

分别取两组大鼠肝脏匀浆备用液样品各5个，进行重复实验。按照上文所述的测定，进行MT含量的测定实验。结果见表3。

2.5 肝脏和血浆金属硫蛋白的测定及与文献测得值比较

根据上述方法，对大鼠（健康雄性普通大鼠，合格号SCSK（川）2004-15，体重约150-250g）的肝脏MT进行了测定，所得MT值为36.78±4.85（?g/g）；血浆中MT值为543.34±55.42 （?g/ml）。

本实验测得的肝脏中的结果与文献测得值比较，结果位于文献报道之间，考虑到金属硫蛋白在组织中含量变异较大，该结果可接受。而本实验测得血浆中的结果远高于文献报道的结果，可能原因为为该实验所用大鼠为长期不间断灌胃应急状态下，产生了高于常态数倍的MT。

3. 讨论

现报道的MT的测定方法中， 汞饱和法迅速而简便，但是由于汞的加入量极其重要，加入量过小，导致测定结果偏低，加入量过大，导致测定结果偏高，所以难以掌握[4]；放射免疫分析法敏感性和特异性强，灵敏度高，检出范围为0.1～300ng/ml。缺点是要求实验室具备一定的放射免疫技术和设备条件，大规模调查成本较高[9]。酶联免疫吸附法离大幅推广应用还有一定距离 [9] 。而本文研究的方法简便、快速、不用同位素镉，灵敏度较好，检测限为40ng [4]。

由于金属硫蛋白在体内微量元素的代谢、重金属中毒的代谢、毒效应发挥与解毒过程中起着极为重要的作用[10]，且金属硫蛋白的基因结构高度保守，在表达上具有高度可诱导性[8]，因此金属硫蛋白在组织中含量变化较大，正常组织和体液中的金属硫蛋白的确切含量还未见报道。

该实验由于要经过多次离心及转移上清液去沉淀处理，而容易误差，因此在实验中要特别注意在转移上清液时尽量彻底，以减小误差。

参考文献

[1] 安建平，王廷璞，邹亚丽，等.镉诱导黄瓜金属硫蛋白的分离、纯化和鉴定[J].安徽农业科学，2008，36（18）：7514-7515，7742.

[2] 卢圣勋，梁贵友.金属硫蛋白与恶性肿瘤关系的研究进展[J].医学综述，2010，16（3）：383-386.

[3] 梁鹏，吴晓萍，廖爱琳.金属硫蛋白检测方法研究进展[J].中国食物与营养，2010，9：56-58.

[4] 李婧.金属硫蛋白检测方法的研究进展[J].现代检验医学杂志，2004，19（3）：64-65.

[5] 励建荣，宣伟，李学鹏等.金属硫蛋白的研究进展[J].食品科学，2010，31（17）：392-395.

[6] 计时华.金属硫蛋白的测定方法[J].国外医学卫生学分册，1990，1：6-9.

[7] 刘晓梅，孙志伟，石龙，等.锌诱导小鼠肝产生金属硫蛋白的实验研究[J].中国公共卫生，2000，16（4）：315-316.

[8] 陶炼晖，王翔朴.金属MT的分离和测定[J].湖南医科大学学报，1991，16（1）：37-40.

[9] 赵京山，尹桂山.金属硫蛋白的生理功能及研究进展[J].生命的化学，1998，18（3）：9-11.

[10] 黄波，金泰虞.金属硫蛋白检测方法的适用性和局限性[J].劳动医学，1999，16（2）：114-115.

作者个人简介：黄伟，男，汉族，初级营养师，学士学位，手机号码：13736339429。