根癌农杆菌介导的玉米自交系A188愈伤组织再生条件的优化
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摘 要：以A188玉米自交系的愈伤组织为材料，研究了影响农杆菌介导玉米转化和再生的各种因素，建立了该自交系的遗传转化体系。结果表明，10～15 mm的幼胚最易诱导出胚性愈伤组织；在侵染液和共培养基中加入乙酰丁香酮能显著提高转化效率；合适的菌液浓度（OD600=04）、共培养时间（3 d）、共培养温度（24℃）有利于提高转化效率。
关键词：玉米；根癌农杆菌；愈伤组织；再生体系
中图分类号：S513.01 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）12-0028-04
Optimization of Conditions for Agrobacterium tumefciens-Mediated
Transformation and Regeneration of Maize Inbred Line a188 Callus
Qiu PingPing1， Xin XiangQi2， Liu WenHao1， Su WenMin1， Zhu XiaoPing1*
（1.College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；
2.Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China）
Abstract The factors affecting the Agrobacterium tumefciens-mediated transformation and regeneration of maize （Zea mays L.） embryogenic callus were optimized， and the genetic transformation system was established for the maize inbred line A188. The results indicated that 1.0～1.5 mm immature embryos were easier to induce embryogenic callus； the addition of acetosyringone in infection solution and common medium could increase the transformation efficiency significantly； appropriate bacterial concentration （OD600=0.4）， incubation time （3 days） and co-culture temperature （24℃） were benefit to increasing formation efficiency.
Key words Maize； Agrobacterium tumefciens； Callus； Regeneration system
农杆菌介导法以其操作简单、低成本、转基因拷贝数较低的优点在植物遗传转化研究中得到了广泛应用，尤其是在双子叶植物遗传转化中取得了显著效果[1，2]。单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，不易通过农杆菌进行遗传转化。但是一些研究表明农杆菌也可以转化单子叶植物玉米，并初步建立了农杆菌介导的转化体系[3，4]。
1975年，Green和Phillips利用玉米幼胚成功诱导出植株以来，利用玉米幼胚在不同培养基上诱导愈伤组织并再生出植株的成功研究颇多[5～7]，并证明幼胚是玉米诱导愈伤组织并再生植株的理想材料[8，9]。本试验拟针对玉米自交系A188幼胚进行愈伤组织诱导和再生体系优化，以期建立高效表达的农杆菌介导的转化体系。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株和质粒 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404和大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α均由本实验室保存；带有Bar选择标记基因、Ubiquitin启动子和PGIP目的基因（辣椒多聚半乳糖醛酸酶可逆性抑制蛋白）的双元植物表达载体pCBUPGIP由本研究室构建。
112 植物材料及培养基 玉米自交系A188由本实验室保存，玉米幼胚取自田间生长的玉米植株。
组培过程中的培养基除了生根培养基用MS作为基本培养基外，其他均使用N6培养基作为基本培养基。各培养基成分详见表1。
12 方法
121 农杆菌培养 植物表达载体pCBUPGIP通过冻融法转化入农杆菌菌株LBA4404中。携带目标载体的农杆菌菌株LBA4404在附加50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平的YEP培养液中，28℃培养至OD600=800，然后4℃、4 000 r/min离心5 min，收集菌体，用N6基本液体培养基重悬，分别稀释至OD600=02、03、04、05、06、08，加入100 mg/L的乙酰丁香酮，暂放28℃，缓慢摇动，用于侵染。
122 玉米愈伤组织的诱导 取玉米A188自交系授粉后10～15 d的幼穗，剥去苞叶，用70%酒精和01%升汞先后进行消毒。然后挑取大小分别为08～10、10～15、15～20 mm的幼胚，盾片向上接种于N6诱导培养基上，24℃暗培养。
123 受体材料的农杆菌转化和再生 选取结构致密、颜色鲜亮、较松散的愈伤组织，用镊子夹碎成2 mm大小的小块，愈伤于上述准备好的菌液中浸泡20 min，期间不停地缓慢摇晃，然后弃去菌液，用灭菌滤纸吸干表面多余菌液，转至N6共培养基上，20～28℃分别暗培养2、3、5、7、8 d。其后将愈伤组织用含400 mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗4～5次，每次10 min。将洗好的愈伤用灭菌滤纸吸干表面水分，转至N6恢复培养基上，避光培养7 d。
将上述愈伤转至N6选择培养基上，暗培养15 d，10～15 d继代1次，筛选继代4～5次。将经过筛选的抗性愈伤组织转至N6分化培养基上分化培养，25℃光/暗（16 h/8 h），诱导胚状体形成和幼苗分化。然后进行生根培养，待长出健壮的根系移栽至温室培养。
按照以下公式计算愈伤诱导率和转化率：
愈伤诱导率（%）=（长出的愈伤组织块数/接入的幼胚数）×100；
转化率（%）=（愈伤组织出现绿芽块数/侵染的愈伤组织块数）×100。
转化率以经过草丁膦（PPT）筛选后能存活的愈伤组织出现绿芽为基准，因为草丁膦对愈伤组织是正向筛选，没有转化成功的愈伤组织对草丁膦没有抗性会逐渐死亡。
124 转化株的PCR鉴定 取含PGIP基因的质粒为阳性对照，非转化植株的DNA为阴性对照，进行PCR扩增鉴定。PGIP基因引物：
上游引物：ATGAAAAAAACTAATCGTGTTAC；
下游引物：TCATTTACATGGTGGCAAT。
2 结果与分析
21 幼胚大小对愈伤组织形成的影响
由图1可以看出，当幼胚大小在08～10 mm之间时愈伤诱导率为42%，10～15 mm之间时，愈伤诱导率明显提高，达到86%，15～20 mm之间时愈伤诱导率下降至63%。由此可见当幼胚大小在10～15 mm之间时，幼胚处于最佳萌发期，萌发活性最高，最易诱导产生胚性愈伤组织。
22 菌液浓度对玉米愈伤组织转化率的影响
试验结果（图2）显示，不同侵染液浓度对转化率的影响差异显著。侵染液OD600在01～04之间时，随着农杆菌浓度的增加，A188愈伤组织转化率从78%升高至113%；而当OD600大于04时，随着农杆菌浓度的增加，愈伤组织转化率逐渐下降。由此可以看出OD600=04时，玉米A188愈伤组织转化率最高。
23 共培养时间对玉米愈伤组织转化率的影响
用OD600=04的农杆菌LBA4404菌液侵染生长良好的愈伤组织，然后分别共培养2、3、5、7、8 d。如图3所示，共培养3 d时，转化率最高，达89%，随着培养时间的延长，转化率逐渐降低。共培养时间过短，T-DNA不能有效地向植物细胞转移，所以转化率不高；但是随着共培养时间的延长，吸附在愈伤组织上的农杆菌增殖增加，使以后的抑菌难度增加，并且农杆菌对玉米愈伤组织的损伤增加，所以不能过度延长共培养时间。
24 共培养温度对玉米愈伤组织转化率的影响
玉米A188愈伤组织经农杆菌侵染后分别在20、22、24、26、28℃下共培养3 d，统计愈伤组织转化率，结果如图4。可以看出在24℃时愈伤组织转化率最高，随着温度的升高转化率逐渐降低。由此可知24℃是最佳共培养时间。
25 玉米A188遗传转化体系的建立
对再生体系的各条件优化后，经过组织培养成功得到转基因玉米A188植株。图5中，A为刚挑取培养2 d 的玉米A188幼胚；B为诱导2个月后筛选出的胚性愈伤组织，用来侵染；侵染后筛选出的愈伤组织经恢复培养逐渐成熟，C为恢复培养一周后的愈伤；D为愈伤组织进行分化培养2周后，愈伤组织逐渐绿化并开始分化绿色生长点，并进一步分化出小苗；E为分化出的小苗进行生根培养一个月后的健壮植株，准备移栽；F为转化植株在无菌土中的长相。
农杆菌介导的玉米A188高效转化再生体系：（1）取授粉后10～15 d的玉米幼穗，剥去苞叶挑取10～15 mm幼胚，盾片向上接种于N6诱导培养基上，24℃暗培养，10～14 d继代1次，至产生Ⅱ型胚性愈伤组织。取继代4～5次、结构致密、颜色鲜亮的Ⅱ型胚性愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料。
（2）农杆菌菌株LBA4404在附加50 mg/L Kanamycin和100 mg/L利福平的YEP培养液中，28℃培养至OD600=800，然后4℃、4 000 r/min离心5 min，收集菌体，用N6基本液体培养基重悬，稀释至OD600=04，加入100 mg/L的乙酰丁香酮，暂放28℃，缓慢摇动，用于侵染。
（3）选取结构致密、颜色鲜亮、较松散的愈伤组织，用镊子夹成2 mm大小的小块，于上一步准备好的菌液中浸泡20 min，期间不停地缓慢摇晃，然后弃去菌液，用灭菌滤纸吸干表面多余菌液，转至N6共培养基上，24℃暗培养3 d。
（4）3 d后将愈伤组织用含400 mg/L的羧苄青霉素的无菌水冲洗4～5次，每次10 min。将洗好愈伤用灭菌滤纸吸干表面水分，转至N6恢复培养基上，避光培养7 d。
（5）将愈伤转至N6选择培养基上，暗培养15 d，10～15 d继代1次，筛选继代4～5次。
（6）将经过筛选的抗性愈伤组织转至N6分化培养基上分化培养，25℃光/暗（16 h/8 h），诱导胚状体形成和幼苗分化。然后进行生根培养，待长出健壮的根系移栽至温室培养。
26 转化植株PCR鉴定结果
提取再生植株叶片基因组DNA作为模板，利用PGIP基因引物进行PCR特异片段的扩增，得到约661 bp条带，与阳性对照位置相同，和预期的PGIP基因的位置相一致；而阴性对照却无任何条带（图6）。说明PCR阳性克隆的细胞中含有目的基因序列，可以初步确定为转化株。
1～4：转基因植株；5：阳性对照；6：阴性对照；
M：DL2000 Plus
3 结论与讨论
大量研究证实愈伤组织可分为三类：Ⅰ型愈伤组织呈结构紧密的块状；Ⅱ型愈伤组织是比较理想的愈伤组织，结构良好，高度松散，颜色鲜亮，也称其为胚性愈伤组织；Ⅲ型愈伤组织呈柔软、松散、水浸状，不具有分化植株的能力。Ⅱ型愈伤组织主要是通过胚胎发生途径分化出植株，Ⅰ型愈伤组织则主要通过器官发生途径分化出植株。玉米植株的再生主要受受体材料、基因型和培养条件的影响，本研究主要对受体材料和培养条件进行研究，并建立了高效表达的再生体系。