角膜溃疡羊膜植入的病理学分析
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继发于炎症或者慢性营养性疾病的角膜溃疡穿孔为眼科急症，溃疡穿孔后眼球结构不稳定，存在发生眼内炎、视力丧失等风险，抑制炎症、修复角膜基质是治疗角膜溃疡、重建眼表的关键因素之一。角膜移植不可能在任何病例中应用，急诊角膜移植相对较少。羊膜能抑制炎症，促进角膜溃疡修复，实验表明可能与羊膜本身含有的不同抗炎蛋白、抑制蛋白水解酶活性、通过凋亡抑制多形核白细胞、减少脂质过氧化反应等有关［1］。本研究观察多层羊膜与人角膜基质整合的病理学特征，回顾性分析羊膜移植治疗角膜溃疡的临床特点。
1资料与方法
1．1一般资料
收集我院2010年2月至2011年1月角膜溃疡患者23例(23眼)，其中右眼14例，左眼9例;男18例，女5例;年龄(47．9±4．6)岁;非感染性角膜溃疡13例，感染控制后角膜溃疡8例，角膜溃疡穿孔2例。感染性角膜溃疡均经过规范化药物治疗。溃疡穿孔2例分别为单纯疱疹病毒感染、细菌性角膜溃疡。
1．2方法
参考手术适应证，根据溃疡深浅、面积确定行多层羊膜填塞及羊膜覆盖。具体如下:采取表面麻醉或球后麻醉，显微镜下刮除溃疡表面坏死组织，彻底清除溃疡周围坏死的角膜基质，暴露溃疡底部及周围健康角膜组织，手术均以单层或者多层羊膜填塞溃疡面，单层羊膜覆盖角膜表面，10-0线间断缝合于角膜缘。显微镜下观察角膜基质厚度、羊膜移植物表面上皮形成、羊膜与角膜基质整合等情况。裂隙灯下观察角膜溃疡的变化，记录分析术后患者自觉症状、视力、眼压、裂隙灯等检查结果以及并发症，连续观察8个月，部分患者接受眼前节照相。术后感染性角膜溃疡根据病情采取相应的抗炎治疗，术后10～14d拆除表层羊膜缝线。
2结果
2．1临床结果
21例患者上皮愈合，溃疡修复。上皮愈合时间为术后10～16d，其中4例先后2次行羊膜移植术，8例感染性角膜溃疡患者均在一次手术后角膜感染症状得到有效控制;2例患者溃疡穿孔羊膜填塞术后分别在18d、30d再次行光学性角膜移植术，其原角膜组织行病理学检查，术后视力明显提高。
2．2裂隙灯检查结果
早期羊膜贴附良好，角膜厚度明显增加，前房形成良好，角膜上皮逐渐愈合，结膜充血减轻;后期形成云翳、斑翳、瘢痕;角膜厚度基本正常(图1-图2)。
2．3组织病理学检查结果
显微镜下HE染色羊膜呈染色均一结构，18d见多层羊膜排列整齐，层次清晰，角膜基质内少量炎性粒细胞浸润，羊膜表面角膜上皮化;30d多层羊膜彼此融合，层次不清，多层羊膜与角膜基质界限模糊，伴有少量新生血管形成，角膜厚度均一;2例角膜组织中均未见病原体(图3-图4)。
2．4并发症
1例细菌性溃疡穿孔患者羊膜移植后再行角膜移植术，术后4个月继发青光眼，行青光眼阀植入术后眼压控制理想。
3讨论
角膜溃疡上皮缺损、基质融解往往导致穿孔、眼内炎、视力丧失等严重并发症。目前角膜溃疡以及微小穿孔的治疗方法包括抗炎药物、绷带型角膜接触镜、氰丙烯酸丁酯组织黏合剂、睑缝术、结膜瓣遮盖［2］，以及近年来开展的角膜胶原交联术［3-5］等。羊膜具有良好生物学特性:羊膜不表达HLA-A、-B、-DR抗原，移植后不发生排斥;其基底膜有良好韧性，利于周围角膜上皮细胞迁徙于羊膜面;羊膜可以刺激角膜上皮细胞再生，抑制成纤维细胞生长，减少瘢痕组织形成;同时羊膜通过抗蛋白酶活性抑制新生血管化，通过抑制炎症因子具有明显抗炎作用;作为载体，羊膜可以接受来自宿主组织的营养，覆盖于溃疡面，提供防护层并抑制感染;羊膜包含大量的神经生长因子，促进神经再生，有利于角膜重建再获得敏感性［6］，因此羊膜可应用于角膜溃疡治疗。临床研究表明，有或没有角膜溃疡穿孔的患者以保存的羊膜作为基底膜，能阻止炎症细胞浸润，减轻角膜组织炎症，减少角膜细胞凋亡，修复角膜上皮缺损［7］。Dek-aris等［8］认为羊膜移植不仅能促进角膜移植术后移植片上皮缺损的修复，而且术后角膜厚度增加，在传统治疗方法无效时，一层或多层羊膜移植能有效地治疗角膜移植片上皮缺损;单层羊膜覆盖后平均角膜上皮化时间为术后2周，多层羊膜移植术后角膜上皮愈合多在3周。本研究中21例患者在羊膜治疗后炎症均明显控制，角膜上皮完全愈合，尤其是非感染性角膜溃疡效果明显，角膜上皮愈合时间为术后10～16d，与Dekaris等［8］报道类似，但我们认为羊膜移植术后角膜上皮愈合时间受多因素的影响，如角膜溃疡大小、原有炎症反应、手术方式等。
多层羊膜用于治疗深层角膜溃疡以及小的溃疡穿孔同样有效［9-11］。羊膜不仅能够作为基底膜促进角膜溃疡上皮细胞的修复，而且能够与角膜基质融合，恢复一定的角膜厚度。目前活体观察羊膜移植术后不同时间羊膜与角膜组织融合的组织病理学资料有限。国内学者发现，角膜溃疡单层羊膜覆盖后羊膜逐渐自行脱落或者呈筛网状融解吸收;1例多层羊膜填塞5个月后行共焦显微镜检查仍可见羊膜组织［12］。Nubile等［13］对22例角膜溃疡患者行多层羊膜移植术，连续观察12个月，其中20眼6个月后角膜溃疡深度、角膜厚度逐渐稳定，共焦显微镜提示术后(15±5)d溃疡面角膜上皮逐渐形成，数周后表层羊膜逐渐退化，深层羊膜与角膜基质逐步融合，修饰过程以羊膜上皮细胞丢失、角膜上皮化、羊膜纤维结构变化、角膜基质细胞迁徙到羊膜基质为特征。显示多层羊膜能与角膜基质良好整合，增加角膜厚度，促进溃疡再上皮化。羊膜与角膜基质整合主要特征是羊膜组织收缩、角膜基质细胞再生。Gris等［14］对神经营养不良型角膜溃疡行羊膜移植治疗后再行穿透性角膜移植，通过对移除的角膜进行病理学分析，观察到以羊膜作为基底膜，原有溃疡表面完全角膜上皮化。在无新生血管、不伴有明显炎症反应患者的角膜基质内羊膜移植物可以维持数月并逐渐吸收;伴有丰富炎症细胞的病例，移植的羊膜快速吸收，一旦吸收，羊膜被新的纤维变性基质取代，纤维变性基质能够维持一定角膜厚度，与原有角膜组织不同，新的“角膜组织”透明性下降。本研究通过病理学直观观察感染性角膜溃疡行羊膜移植后角膜与异体羊膜愈合情况，HE染色羊膜呈染色均一结构，18d见多层羊膜排列整齐，层次清晰，角膜基质内少量炎性粒细胞浸润，羊膜表面角膜上皮化;30d多层羊膜彼此融合，层次不清，多层羊膜与角膜基质界限模糊，伴有少量新生血管形成，角膜厚度均一。由于观察例数及客观条件限制，我们无法观察羊膜与角膜远期整合形态，但是我们观察到在感染性角膜溃疡行羊膜移植后早期羊膜仍然与角膜基质良好的融合，并维持一定角膜厚度，羊膜面角膜上皮化，溃疡面愈合。以上资料同时提示我们，为避免羊膜过早吸收，术中彻底清创、去除炎症病灶十分重要。尽管术后角膜透明性下降，但在没有角膜材料的情况下，多层羊膜移植可以作为角膜溃疡微小穿孔的初始治疗，这样不但可以维持眼球良好形态，挽救眼球视功能，而且使得眼科医师能够有足够的时间获得角膜片，为可能进行的角膜移植做准备，以进一步改善患者视功能［15］。
我们认为，为获得良好的手术效果，对于感染性角膜溃疡必须经过严格规范的治疗，感染控制后再行羊膜移植术，术中必须彻底清除病变组织至透明角膜基质，多层羊膜之间贴附紧密，羊膜下勿残留气泡和积液，选择新鲜的羊膜可能更有利于溃疡面愈合。我们的资料表明对于角膜溃疡微小穿孔的病例使用多层羊膜填塞与覆盖是有效的。羊膜能够与角膜基质良好地整合，促进角膜溃疡愈合，维持一定角膜厚度，为下一步治疗创造良好手术时机和条件。然而术后18d角膜组织病理显示角膜基质内仍有少量炎性粒细胞浸润，提示术后早期合理抑制炎症仍然是必要的。