痔特佳片微生物限度检查方法验证

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[摘要] 目的:建立痔特佳片微生物限度检查方法,并对方法进行验证。方法:采用常规法和培养基稀释法。结果:痔特佳片用培养基稀释法进行微生物限度的细菌检查。结论:确立了微生物限度检查方法,保证微生物限度检查方法的有效性。

[关键词] 痔特佳片;微生物限度检查;方法验证

[中图分类号]R286[文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2009)07(b)-136-02

痔特佳片是由槐角(炒),地榆炭、黄芩、当归、枳壳、防风、鞣质等8种成分组成的中药复方制剂。其质量标准中未列微生物限度的检查方法。本文按照《中国药典》2005年版[1]和中国药品检验标准操作规范[2]及有关文献[3-5],建立了痔特佳片微生物限度检查方法,方法经验证有效可行。

1 材料

1.1培养基

营养肉汤琼脂培养基,营养肉汤培养基,改良马丁培养基(中国药品生物制品检定所提供)。稀释剂为0.9%灭菌氯化钠溶液,pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液(本所配置)。

1.2 药品

痔特佳片(营口宏生药业有限公司,批号:20060117)。

1.3菌种

大肠埃希菌[CMCC(B)44102],金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003],枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501],白色念球菌[CMCC(F)98001],黑曲霉菌[CMCC(F)98003],由中国药品生物制品检定所提供。

2 试验部分

2.1菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基,35～37℃培养18～24 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,23～28℃培养24～48 h。再分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50～100 cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,23～28℃培养5～7 d,使大量的孢子产生,加入3～5 ml的0.9%无菌氯化钠溶液,孢子洗脱,吸出孢子菌液至灭菌试管内,稀释至每毫升含50～100 cfu的菌悬液。

2.2 供试液的制备

取供试品10 g,加稀释剂100 ml,制成1∶10供试液备用。

2.3试验方法

2.3.1常规法:采用1 ml/皿的供试液。

2.3.2培养基稀释法:采用0.2 ml/皿的供试液。

2.4回收率测定(验证试验分4组,至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各次试验的菌回收率)

2.4.1试验组:取1∶10的供试液和试验菌液各1 ml,分别注入两个平皿,立即注入45℃的融化的相应的培养琼脂培养基15～20 ml,摇匀,凝固后,将平板倒置于规定的温度培养至规定时间,做菌落计数。

2.4.2菌液组:取上述试验菌液,测定其加入的试验菌菌数。

2.4.3供试液对照组:测定供试品本底菌数。

2.4.4稀释剂对照组:用相应的稀释剂代替供试品,加入试验菌液,使最终菌浓度为1 ml含50~100 cfu,按试验组的供试液制备方法和菌数计数方法测定其菌数。

2.4.5结果判断:实验组和稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。

3 试验结果

4 讨论

根据结果判断,从表1可见,稀释剂的菌回收率均在70%以上。从表2可见,痔特佳片用常规法,金黄色葡萄球菌的回收率低于70%,说明该样品对金黄色葡萄球菌有抑菌作用,但用培养基稀释法,五种菌的回收率均高于70%。因此,可用培养基稀释法进行痔特佳片的微生物限度检查。

操作过程的各环节对回收率有影响。应注意培养基温度,建议用水浴保温效果好。菌落计数误差对验证方法的影响:当细菌生长小而密集时,极易产生计数误差,故菌落计数时应仔细观察,必要时借助放大镜或低倍显微镜,如难区别,可适当延长培养时间。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社.2005:一部附录71-78,二部附录93-101.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京:中国医药科技出版社,2005:二部325-331.

[3]马越,特玉香.16种中成药微生物限度检查法方法验证[J].中国药品标准,2005,6(6):356-359.

[4]马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社,2000:61-65.

[5]王知坚,邵惠琴,杜芸,等.药品微生物限度检查法有效性验证实验研究[J].中国现代应用药学杂志,2004,21(3):211-213.

(收稿日期:2009-04-22)