血管紧张素受体拮抗剂在进展性肾炎大鼠模型中对慢性低氧引起肾小管间质损害的抑制作用

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[摘要] 目的：观察并探讨血管紧张素受体拮抗剂（ARB，氯沙坦）对进展性肾炎大鼠肾小管间质低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的影响及肾小管间质损害的抑制作用。方法：将大鼠随机分为假手术组、模型组和不同剂量氯沙坦治疗组，除假手术组外，其余各组行右肾切除并两次注射IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody 建立进展性肾炎大鼠模型，各组分别予饮用水或不同剂量氯沙坦灌胃4周，观察各组大鼠肾功能、尿蛋白、收缩压、HIF-1α表达及肾组织病理的改变。结果：与模型组比较，氯沙坦组大鼠尿蛋白减少，肾功能改善，肾小管间质HIF-1α mRNA含量显著减少，肾组织病理改变明显减轻，尤其在大剂量氯沙坦组。结论：氯沙坦抑制了进展性肾炎大鼠肾小管间质的损害可能与改变HIF-1α的表达有关。

[关键词] 血管紧张素受体拮抗剂；慢性低氧；进展性肾炎；低氧诱导因子-1α

[中图分类号] R-332 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2011）08（a）-０15－０4

Chronic hypoxia inducing tubulointerstitial injury is inhibited by Angiotensin II receptor blocker in a progressive model of rat glomerulonephritis

ZHA Yan1, YU Fangfang1, SHEN Yan1, ZHA Yong2*

1.Department of Nephrology, Guizhou Province People′s Hospital, Guizhou Province, Guiyang 550004, China; 2. Guizhou Province Department of Public Health, Guizhou Province, Guiyang550004, China

[Abstract] Objective: To observe and probe into the effects of angiotensin Ⅱ receptor blocker (ARB, losertan) on hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and the inhibition of tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis. Methods: The rats were randomly divided into sham operation, model and different doses losartan therapy groups. Excepted the sham operation group, the rest groups underwent right nephrectomy and injected IgG (OX-7) mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody twice, were established as progressive nephritis model. Either drink water or different doses losartan were irrigated into the stomachs of the rats in all groups for 4 weeks. And the effects of losartan on renal function, proteinuria, SBP, HIF-1α mRNA, and the tubulointerstitial pathological changes were examined. Results: In losartan therapy groups, proteinuria was decreased, the renal function was improved, and these expression of HIF-1α mRNA was suppressed. Tubulointers titial injury was ameliorated. Regression of histological damage was observed in losartan therapy groups, especially in high dose losartan group. Conclusion: Losartan may inhibit the tubulointerstitial injury by decreasing the high level of HIF-1α in the progressive model of rat glomerulonephritis.

[Key words] Angiotensin Ⅱ receptor blocker; Chronic hypoxia; Progressive nephritis; Hypoxia inducible factor-1α

“慢性低氧学说”是目前肾脏病学界的研究热点，该学说提出：肾小管间质部分的慢性氧缺失是促进肾脏疾病进展和纤维化的重要原因[1]。体外实验表明低氧可以刺激细胞分泌低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α） 的表达[2]。本课题旨在通过动物实验探讨肾小管间质细胞HIF-1α mRNA的高表达在慢性肾间质纤维化中的作用，及氯沙坦对其表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

氯沙坦购自杭州默沙东制药公司，小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购于美国 Neo Markers 公司，IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody购于美国Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 仪器

全自动多功能生化分析仪（日本Hitachi公司）；SN-628放射免疫γ计数仪（中国科学院上海原子核研究所）；光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 动物模型及分组

雄性Wistar大鼠30只（由重庆腾鑫生物技术公司提供，二级），体重（126.7±10.0）g。将大鼠随机分为4组：假手术组（10只，只做肾包膜剥离，不做肾脏切除）；模型组（20只，选用进展性肾炎模型[2]），行右肾摘除术，分别于术后第1、2周予鼠尾静脉注射IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody 1.2 mg/kg 2次，于第4周时在麻醉下处死大鼠（n=5）；剩余模型组大鼠随机分为未给药组（n=5，每日饮用水灌胃，连续4周）、小剂量氯沙坦组[n=5，20 mg/（kg・d）]氯沙坦加入饮用水中灌胃，连续4周）、大剂量氯沙坦组[n=5，80 mg/（kg・d）氯沙坦加入饮用水中灌胃，连续4周]，第8周在麻药下处死以上各组大鼠。大鼠处死前留取24 h尿液，麻醉后即心脏采血及处死后即取左肾标本，于-70℃冰箱保存，用作生化、组织病理和分子生物学检查。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 24 h尿蛋白定量分别于第4、8周收集24 h尿液，用双缩脲法测定尿蛋白含量。

1.4.2 血生化检测 取大鼠心脏血，测定血肌酐（Scr）。

1.4.3 肾组织病理学检查5％中性甲醛固定肾组织，石蜡包埋，常规HE、PAS、MASSON染色，显微镜下观察肾脏病理改变。

1.4.4 原位杂交法检测取3 μm厚石蜡切片，常规脱蜡至水，灭活内原性酶，热修复抗原，抗原抗体反应，DAB显色、脱水、透明、封片、显微镜观察。HIF-1α mRNA原位杂交所用探针为经地高辛标记的针对HIF-1α基因的多相寡核苷酸探针，操作步骤按HIF-1α原位杂交试剂盒（Boster）说明书进行。阳性产物呈深紫色，不加探针为阴性对照。

1.4.5 肾脏病理、原位杂交分析①肾间质面积测量：在400倍光镜下用PAS染色标本，每个标本选取10个肾小管间质视野（避开肾小球和大血管），每个视野分别测量肾间质面积与统计场面积的比值。②原位杂交分析：采用显微图象分析系统（Olympus C3040-ADU）对各组染色结果进行积分光密度值（integral optical density，IOD）测定，每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD，取平均值。

1.5 统计学处理

数据用平均值±标准差（x±s）表示。用SPSS 11.5统计软件分析，组间差异比较采用t检验，相关性检验采用Pearson分析。

2 结果

2.1 收缩压

第4周时模型组和假手术组间无明显改变，第8周大剂量氯沙坦组较8周未给药组（P

2.2 生化指标检测

①血肌酐：第4周模型组较假手术组明显升高（P

2.3 肾组织形态学

PAS染色显示（图1）：假手术组肾小管间质形态基本正常，肾间质相对面积为0.075±0.006；第4周手术组可见肾小管上皮细胞萎缩、部分肾小管扩张、间质水肿，炎症细胞浸润并出现纤维化，肾间质相对面积扩大为0.180±0.030，与假手术组比较差异有统计学意义（P

2.4 HIF-1α mRNA的原位杂交检测

假手术组表达微弱，在第4周模型组和第8周未给药组HIF-1α mRNA表达明显增加，主要集中在肾小管上皮细胞的胞浆，与假手术组比较差异有统计学意义（P

3 讨论

近来有研究提出[1,3]肾小管-间质细胞的慢性低氧可能在肾纤维化的发生、发展中起重要作用。如低氧可使人肾脏成纤维细胞TGF-β mRNA表达增加，在CTGF mRNA转录增加这一过程中也需要低氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的存在，而且HIF-1介导缺氧刺激CTGF表达独立于TGF-β途径[4]。HIF-1α在体内特异地受氧浓度调节，可作为低氧的指标[5]。因此笔者在进展性肾炎（progressive nephritis）大鼠模型[6]中，以氧浓度敏感的HIF-1α为低氧标志物，观察在慢性低氧状态下，肾小管间质细胞HIF-1α mRNA的表达，以及予不同剂量血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦干预后HIF-1α mRNA表达的变化，探讨氯沙坦在慢性低氧状态下是否对肾小管间质的损害有抑制作用。

进展性肾炎大鼠[5]是目前观察慢性肾脏病进展比较理想的动物模型，该模型于4周后肾小管间质的有效循环血流量下降近40%，出现持续的肾小管间质缺血缺氧，肾功能处于氮质血症期直至11周，可持续使用血管紧张素受体拮抗剂，并有利于观察低氧状态对肾脏的损害。本研究表明在第4周模型组，血肌酐（P

血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦可竞争性抑制AngⅡ与其受体结合，且主要与AT1结合，阻断AngⅡ引起的血管收缩、交感兴奋、醛固酮分泌增多等作用，因而可以缓解肾损伤[9-10]。

本研究发现, 通过应用不同剂量的氯沙坦治疗4周后, 小剂量氯沙坦组的血肌酐和24 h尿蛋白较第4周模型组、8周未给药组（P

[参考文献]

[1]Fine LG, Norman JT.Chronic hypoxia as a mechan ism of progression of chronic kidney diseases:from hypothesi s to novel therapeutics[J].Kidney Int,2008,74(7):867-872.

[2]Greijer AE,van der GP,Kemming D,et al.Up-regulation of gene expression by hypoxia is mediated predominantly by hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)[J].J Pathol, 2005,206(3):291-304.

[3]Takiyama Y,Harumi T,Watanabe J,et al.Tubular injury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by metformin: a possible role of HIF-1α expression and oxygen metabolism[J].Diabetes,2011,60(3):981-992.

[4]Higgins DF,Bijiu MP.Hypoxic induction of TGF-β is directly mediated by Hif-1[J].Am J Physiol Renal Physiol,2004,287(6):F1223-F1229.

[5]Norman JT,Clark IM. Hypoxia promotes fibrogenesis in human renal fibroblasts[J].Kidney Int,2008,58(6):2351-2366.

[6]Matsumoto M.Hypoperfusion of peritubular capillaries induces chronic hypoxia before progression of tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis [J].J Am Soc Nephrol,2004,15(6):1574 -1581.

[7]Kimura K,Iwano M,Higgins DF,et al.Stable expression of H IF-1α in tubular epithelial cell promotes interstitial fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,295(4):F1023-F1029.

[8]Manotham K, Tanaka T, Matsumoto M, et al. Evidence of tubular hypoxia in the early phase in the progressive nephritis model[J].Am Soc Nephrol,2004,15(5):1277-1288.

[9]Kong X,Zhang DY,Wu HB,et al.Losartan and pioglitazone ameliorate nephropathy in experimental metabolic syndrome rats [J].Biol Pharm Bull,2011,34(5):693-699.

[10]Meier P,Maillard bining blockers of the renin-angiotensin system or increasing the dose of an angiotensin[J].Hypertens,2011,29(6):1228-1235.

（收稿日期：2011-06-10）