LC―MS/MS法检测生鲜乳中三聚氰胺的一点改进
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[摘 要] 在《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388-2008）的基础上，对生鲜乳中三聚氰胺提取和复溶步骤略作改进，达到操作简便，结果准确可靠。以检测限500～1000倍做添加，用1%三氯乙酸作为提取溶剂，采用涡旋震荡的方式辅助溶剂萃取法提取生鲜乳，提取液用Waters Oasis MCX固相萃取柱进行净化浓缩，氮气吹干后再用流动相做同等倍数的稀释。以Waters ACQUITY BEH HILIC色谱柱为分离柱，在正离子模式下以电喷雾电离串联质谱仪进行测定。对流动相组分和流动相添加剂对质谱的离子化进行考察，在2.0～20.0ng/mL范围内线性关系良好（R2>0.99），样品在10.0μg/kg的添加水平上回收率为85%～97%，相对标准偏差为3.0%。本方法能够克服生鲜乳中三聚氰胺检测时基质干扰大，影响定量准确度的问题。
[关键词] 高效液相色谱- 电喷雾质谱/ 质谱 三聚氰胺 生鲜乳 GB/T 22388-2008
[中图分类号] S827 [文献标识码] B [文章编号] 1003-1650 （2014）10-0151-01
三聚氰胺（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，常温下呈白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚类。作为化工原料，三聚氰胺与甲醛缩合聚合可制得三聚氰胺树脂，主要用于塑料及涂料工业，也可作纺织物防摺、防缩处理剂；其改性树脂可做色泽鲜艳、耐久、硬度好的金属涂料；还可用于坚固、耐热装饰薄板，防潮纸及灰色皮革鞣皮剂，合成防火层板的粘接剂，防水剂的固定剂或硬化剂等；部分亚洲国家，也被用来制造化肥。
三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66%），加之其生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大地利益驱动，食品中三聚氰胺每增加一个百分点，通过凯氏定氮法测定的蛋白质会虚长4个百分点，费用只有真实蛋白原料的1/5，所以“增加”产品的表观蛋白质含量是添加三聚氰胺的主要原因。但是，中国国家食品质量监督检验中心明确指出，三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的。
2008年三聚氰胺奶粉事件后，国家标准化管理委员会在原有国家或行业标准的基础上了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388-2008），该标准涉及高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱/质谱3种检测方法，3种方法的定量限分别为2mg/kg、0.05mg/kg和0.01mg/kg。
本文所采用的方法较GB/T 22388-2008中的液质联用法前处理更为简便，能有效消除基质干扰，定量限更低，更适用于当前实验室检测。
一、实验部分
1.仪器与试剂
Xevo TQ-S型串联质谱仪，配I-Class型超高效液相色谱仪，美国Waters公司；固相萃取装置（美国 Waters公司）；多管涡旋振荡器（北京 TARGIN）；高速冷冻离心机（德国 Hermle）；十万分之一天平（XS205，瑞士 METTLER-TOLEDO）；百分之一天平（TE612-L，德国 Sartorius）；氮吹仪（美国 Organomation Associates Jnc. N-EVAPTM 112）；0.22μm微孔滤膜（津腾，德国MEMBRANA公司原产膜）；1mL无菌注射器。
三聚氰胺对照品（纯度：99%，上海安谱公司）；甲醇、乙腈均为HPlc级别（美国Fisher公司）；三氯乙酸、氨水为分析纯（天津科密欧）；实验室用超纯水（娃哈哈瓶装纯净水）；Oasis MCX固相萃取柱（60mg/3cc，美国Waters公司）；0.22μm微孔滤膜；1mL无菌注射器。
2.标准溶液的配制
三聚氰胺标准储备液（100μg/mL）：精密称取三聚氰胺标准品10mg，用20%甲醇水溶液溶解并定容至100mL，-20℃保存。
三聚氰胺标准曲线：将100μg/mL的标准储备液经过分步稀释成浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL和20ng/mL的标准曲线，稀释液为70%乙腈水溶液。
三聚氰胺基质标准工作液：根据需要吸取适量的三聚氰胺标准储备液加至“1.3 样品的提取和净化”中的空白样品洗脱液中。
3.样品的提取和净化
准确称取空白样品2g（精确至0.01g）于50mL塑料离心管中，加入10mL1%三氯乙酸溶液，置于多管振荡器上涡旋20min，以每分钟8000转的速度离心10min，将上清液转移至另一10mL塑料离心管中，待净化。
取MCX固相萃取柱，分别经3mL甲醇和3mL水活化后，准确移取带净化上清液5mL通过固相萃取小柱，然后依次用3mL水、3mL甲醇淋洗小柱，控制流速为1mL/min，最后用5%氨化甲醇5mL洗脱固相萃取柱，洗脱液收集于10mL离心管中。将洗脱液置于50℃水浴中氮气浓缩至干，加1.0mL70%乙腈水溶液充分溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤后供液相色谱-质谱/质谱检测。
注：同时做空白1个、基质空白5个（用于制备基质标准工作液）、空白添加14个。
4.色谱条件
色谱柱：ACQUITY BEH HILIC 2.1×100mm，1.7μm（Waters）
柱温：30℃；样品室温度：10℃；进样量：2μL
流动相及洗脱条件：流动相A ：超纯水（30%）；流动相B：乙腈（70%）；以0.6mL/min的流速等度洗脱，保持3min。
5.质谱条件
Polarity：ES+
Capillary （kV） 3.40
Cone （V） 46.00
Source Offset （V） 50.0
Source Temperature （°C） 150
Desolvation Temperature （°C） 450
Cone Gas Flow （L/Hr） 150
Desolvation Gas Flow （L/Hr） 1000
Collision Gas Flow （mL/Min） 0.15
Nebuliser Gas Flow （Bar） 7.00
LM 1 Resolution 2.8
HM 1 Resolution 14.7
LM 2 Resolution 2.8
HM 2 Resolution 14.6
6. 质谱采集参数（见表1）
表1：三聚氰胺的监测离子及质谱采集参数
*定量离子
二、结果与讨论
本文较GB/T 22388-2008在前处理上略有改进，不需要进行过滤处理。此外，本文与GB/T22388-2008的最大不同之处在于添加和复溶两个步骤上。本人按照GB/T22388-2008的要求进行添加试验，经过反复验证，并通过基质添加定量的方式进行校正，发现直接定量的准确度很低，基质标准曲线更是达不到线性要求（R2仅为0.73），这是由于基质干扰较大造成的，此定量方式不适用。基于以上的试验，本人在初始添加时即将添加浓度提高至检测限的500～1000倍，经提取净化、氮气浓缩，在复溶时，用流动相做同样倍比的稀释，在曲线线性关系良好（R2>0.99）的基础上对添加进行定量（见图1），在10μg/kg的添加水平上回收率在85%～97%之间，RSD为3.0%（n=14）。通过不同浓度的添加来确定本方法检测最低限，经试验数据确定本方法检测限为3.0μg/kg。因此，本人认为，此方法操作简单，能很好的消除基质干扰，检测限更低，测定结果准确可靠，适用于实验室生鲜乳中三聚氰胺残留检测。
图1 三聚氰胺标准曲线