蓝莓外植体消毒的几种方法对比研究

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摘要：通过对比不同种类消毒剂、不同消毒时间对蓝莓茎段消毒效果，以筛选出最适合蓝莓消毒的方法，结果表明，最适合蓝莓外植体消毒的方法：0.1%HgCl2浸泡9min。本研究结果将为蓝莓外植体消毒提供借鉴。

关键词：蓝莓；外植体；消毒

蓝莓，杜鹃花科，越桔属，多年生灌木小浆果果树。蓝莓果实中花青素、多酚等抗氧化物质的含量很高（杨红澎，2010），能使心血管的功能有所改善，积累的胆固醇的量有所下降。一些专家学者为了产业化快速培育蓝莓种苗，已经开展了对其组织培养体系的研究（刘太林，2012）。

1.材料与方法

1.1供试材料

组培所用的蓝莓枝条为半高丛蓝莓北蓝品种，于2014年5月采自于辽宁林业职业技术学院蓝莓实验基地。

1.2材料处理

将休眠植株的木质化枝条冲洗干净，插于水桶中放在25℃的温室中，每天换1次清水。1周后枝条顶芽和上部侧芽陆续伸长，新叶逐渐展开。2～3周时采取新抽出的嫩枝为外植体。

1.3外植体表面消毒

剪取蓝莓嫩枝条，用自来水冲洗干净，并加少量洗衣粉洗涤，搅动5min，再用自来水冲洗约60min，剪成约1～2cm的小段。用70%酒精、含1%吐温80的0.75%次氯酸钠溶液和0.1%升汞溶液及不同的消毒时间组合，对茎段进行消毒处理，共设计了9种对蓝莓茎段的消毒试验方案：分别以70%酒精、0.75%NaCIO、0.1%HgCl2各消毒7、9、11min。消毒时不断摇动，消毒后的茎段用无菌水冲洗4次，吸干水分，再用无菌纸沥干备用。切去基部受损组织，按无菌操作要求接种于培养基上，观察在不同消毒时间内使用不同消毒剂后的消毒效果。

1.4数据处理

依据上述办法进行蓝莓接种，每种消毒方式接种3次，记录消毒效果。

污染率=（外植体中染菌的数量/所有接种的外植体总数）×100%

死亡率=[（死亡的外植体数量+愈伤失败的外植体数量）/接种外植体的总数]×100%

2.结果与分析

通过统计方法，可以计算出蓝莓外植体的污染率和死亡率（周历萍等，2011），污染率分别为96.70%、86.70%、83.30%、93.70%、90.00%、80.00%、66.70%、43.30%、53.30%；所对应的死亡率分别为0、0、3.30%、3.30%、0、3.30%、0、0、6.70%。因此，在此试验中，最适合蓝莓外植体消毒的方法：0.1%HgCl2浸泡9min，可为蓝莓组织培养的研究提供理论依据。

从结果中我们不难看出，所选消毒时间在外植体能承受的范围内，单一的处理时间越长，效果越好，污染率越低。但0.1%HgCl2毒力强，对植物材料杀伤性较强，消毒时间过长，容易对植物材料造成损失。除第7种处理方式外，各消毒剂中，0.1%HgCl2因其在短时间内可对外植体表面菌起到毒害作用，因而消毒效果要好于70%酒精。70%的酒精也有较强渗透力，通过很快穿入植物体内毒害外植体表面菌，消毒的效果要比次氯酸钠明显。而2%次氯酸钠最差，2%次氯酸钠消毒7min的消毒效果远不及其他处理方式的消毒效果，污染率最高；0.1%HgCl2消毒9min的消毒效果最好，最终成为此次试验蓝莓外植体消毒方法。

3.讨论

陶兴魁等（陶兴魁等，2013）研究表明：“一般而言，菌类污染污染率应控制在8%以内，消毒剂的使用既要能够把外植体上的病菌杀灭，又必须容易被无菌水从外植体上冲洗掉或自行分解而不至于对外植体本身产生毒害作用，影响其生长。0.1%的升汞因其有剧毒，且消毒后难以除去残余的汞，对外植体有杀伤作用，所以使用后要应用大量无菌水冲洗多次，减少其对植物的毒害作用。2%NaClO容易清洗，但同时对外植体上的病菌的杀害作用也随之减少。70%酒精渗透力很强，在短时间内便可进入植物细胞行使其毒力作用，所以应用酒精消毒一般是在15～30s之内，即便这样，也可能会造成外植体一定的死亡率。”

在消毒过程中，消毒剂具有很强的杀伤力和穿透力，容易杀死或损失植物细胞，造成外植体长势不良，因此在植物组织培养过程中，要尽量降低污染率，同时还要尽可能减少消毒剂对外植体的伤害。