羽绒羽毛中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检测方法研究
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摘要:针对GB/T 10288―2003《羽绒羽毛检验方法》和FZ/T 80001―2002《水洗羽毛羽绒试验方法》中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检验操作方法，结合实际检验工作，研究了亚硫酸盐添加量、多粘菌素B添加量、培养温度和培养时间与检出菌落数的关系。结果发现，每100mL培养基中添加1mL 10%亚硫酸钠溶液，1mL～2mL多粘菌素B，并且培养温度为36℃～40℃时最利于亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的生长繁殖。
关键词：亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌；羽绒羽毛；微生物
引言
我国的羽绒羽毛资源十分丰富，并且是世界上最大的羽绒及其制品的生产国、出口国和消费国，产量占世界总产量的70%以上。羽绒是一种动物源性产品，卫生安全问题尤为重要，而亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌广泛存在于羽绒羽毛原料中，生产过程中灭菌处理不严格就会有残留。
亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌是梭状芽孢杆菌属的一群细菌，能形成芽孢，并还原亚硫酸盐产生硫化物，厌氧生长，具有动力，且革兰氏阳性[1]。该菌在自然界中分布广泛，通常存在于人和动物粪便排泄物、废水和土壤中。该菌具有一定的致病性，可引起创伤感染、食物中毒和坏死性肠炎。
我国羽绒羽毛中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检验依照国家标准GB/T 10288―2003《羽绒羽毛检验方法》和行业标准FZ/T 80001―2002《水洗羽毛羽绒试验方法》。但是这两个标准中某些技术参数不很完善，对检验过程的某些问题指导性不强。本文参照上述两个标准并结合实际亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验工作，研究了培养时间、培养温度、亚硫酸盐添加量和多粘菌素B添加量对检出菌落数的影响关系，以期掌握亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验的关键点，提高检验水平。
1试验部分
1.1试剂与材料
羽绒羽毛：取自某品牌送检原料亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验呈阳性样品；
0.1%灭菌的蛋白胨生理盐水：蛋白胨1g，氯化钠8.5g，蒸馏水1000mL；
亚硫酸铁多粘菌素B培养基：胰蛋白胨15g，酵母浸膏10g，柠檬酸铁胺0.5g，亚硫酸钠1g，琼脂16g，10mL多粘菌素B，1000mL蒸馏水；
革兰氏染色液试剂盒（北京陆桥技术有限责任公司）；脱脂棉纱布（河南焦作联盟卫生材料有限责任公司）。
1.2试验仪器
显微镜（XS-212，江南仪器厂）；调速多用振荡器（HY-2，江南仪器厂）；厌氧培养箱（1029，美国热电公司）。
1.3试验方法[2-3]
1.3.1试样前处理
用灭菌一次性手套取出12g（精确到0.1g）试样，放入经过灭菌处理的三角烧瓶中，加入1200mL 0.1%无菌蛋白胨生理盐水，无菌室中室温振荡3h。通过消毒纱布过滤溶液，取该溶液5mL于经过灭菌处理的三角烧瓶中待用。
1.3.2亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的测定
将5mL样品滤液置于75℃水浴中处理10min。取处理后的原始滤液1mL做10倍递增稀释，同时即以吸取该稀释度的1mL稀释液于灭菌平皿内。及时将晾至（46±1）℃的亚硫酸盐多粘菌素B培养基注入平皿约15mL，小心转动使试样与培养基充分混匀。待凝固后，再用5mL相同培养基覆盖表层。再次凝固后置于厌氧培养箱中37℃厌氧培养48h。
1.3.3菌落计数和确证试验
厌氧培养48h后，计数黑色和暗棕色菌落。取特征菌落进行确证试验，镜检为革兰氏阳性梭状芽孢杆菌，过氧化氢酶试验阴性。
2结果与讨论
2.1亚硫酸盐的影响
亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌以还原亚硫酸盐成硫化氢为主要特征。因此，对该菌进行检验的选择性培养基中一定含有亚硫酸盐。试验中对培养基中亚硫酸盐的添加量进行了优化，结果表明，每100mL培养基中添加10%亚硫酸钠溶液为1mL时，最利于亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的生长繁殖（见图1）。
图1不同Na2SO3添加量的检出菌落图
2.2多粘菌素B添加量的影响
多粘菌素B是由多粘芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素，对大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性杆菌有抑制或杀菌作用。亚硫酸铁多粘菌素B培养基中添加多粘菌素B能有效地抑制革兰氏阴性杆菌的生长，提高对亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验的选择性。试验发现，多粘菌素B的添加量对亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检出菌落数有一定影响。添加量在每100mL培养基中1mL～2mL时最有利于亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的生长（见图2）。
2.3培养温度的影响
温度是影响机体生长与存活的最重要因素之一。在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加，温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如果温度继续提高，细胞功能急剧下降以至死亡[4]。试验发现，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的培养温度在36℃～40℃时最利于其生长（见图3）。
图2不同多粘菌素B添加量的检出菌落图
图3培养温度对检出菌落的影响（a, 阳性样品; b, 空白）
2.4培养时间的影响
当少量微生物接种到一个恒定容积的培养基中，在适宜条件下培养。开始有一短暂时间，细胞数并不增加，以后增加很快，然后又趋于稳定，最后逐渐下降[5]。在亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的培养过程中，培养时间过短，可见菌落过少；时间过长，则易造成菌落相连或染菌。因此，在48h内应间隔一段时间计数一次，如发现菌落相连，则以上一次计数为准。 试验选取亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验阳性羽绒样品，取三份样品进行平行试验，并记录不同培养时间的检出菌落数（见表1）。
表1培养时间的影响
3结论
亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌是羽绒羽毛制品微生物检验的重要指标。依照GB/T 10288―2003和FZ/T 80001―2002进行检验时，培养温度、培养时间等因素都会影响亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的生长，因此要严格控制各项环境条件和培养基配方，提高检验的准确性，确保检验质量。
参考文献:
[1] 陈彦长. 常见细菌及检验实用技术[M]. 北京：中国科学技术出版社, 2004.
[2] GB/T 10288―2003 羽绒羽毛检验方法[S].
[3] FZ/T 80001―2002 水洗羽毛羽绒试验方法[S].
[4] 魏明奎. 微生物学[M]. 北京：中国轻工业出版社, 2009.
[5] 黄怡,谭玉静,陈慧，等. 羽毛羽绒微生物检测方法初步研究[J]. 中国纤检, 2008 (10)：44-47.
（作者单位：北京市纺织纤维检验所）
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