转基因棉对蚯蚓的影响
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转基因抗虫棉给人类带来经济效益的同时, 也存在生物安全性问题[1 3]。转基因抗虫棉的外源基因可能来自植物、动物或微生物, 例如转 Bt 基因棉花中的外源基因来自于微生物。这些可能出现的新组合、新性状是否会改变原有的生态环境, 并影响到生态系统稳定性, 已引起各方面的关注[4 6]。转基因抗虫棉的抗虫基因表达蛋白进入土壤生态系统后,可以进入昆虫(包括靶标害虫和非靶标害虫)体内被降解[7], 但也会残留在土壤中[8], 改变土壤的特异生物功能类群以及土壤的生物多样性[9 11]。蚯蚓通过影响土壤的物理和生物性质而影响对植物养分的供应,它在土壤肥力上的重要性已为大家所公认[12 14]。Saxena 等[15]研究表明种植转 Bt 基因玉米和非转基因母本玉米的土壤对大蚯蚓(Lumbricus terrestris)的死亡率和体重方面的影响没有显著差异, 但在其肠道和排出的泥土中检测到了 Bt 毒素。如果把蚯蚓放到没有种植过转基因玉米的新鲜土壤中 2~3 d 后,其肠道内的毒素就检测不到了。Zwahlen 等[16]研究表明转基因玉米对成年和幼年大蚯蚓都没有致死效应, 但室内培养 200 d 后, 在含有转基因玉米叶片土壤中成年大蚯蚓的体重比初始体重降低 18%, 而在含有非转基因玉米叶片土壤中成年大蚯蚓的体重比初始体重仅降低 4%[16]。Vercesi 等[17]研究也表明转基因玉米对蚯蚓的存活率、繁殖和生长情况均没有显著影响, 只是在高剂量 Bt玉米组织处理下的蚯蚓茧孵化显著低于非 Bt 玉米组织处理。目前国内外针对转基因抗虫棉对蚯蚓的影响研究十分有限[18], 而且大多数研究表明转基因植物对蚯蚓的影响不显著。本文通过室内喂养试验, 研究了转基因抗虫棉对蚯蚓生长、生殖及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响, 以期为揭示转基因抗虫棉对蚯蚓的影响机理提供科学依据。
1材料与方法
1.1基质的准备
采集转基因抗虫棉(“中棉所 41”, 携带 Bt 和CpTI 双价外源基因)和非转基因抗虫棉(“中棉所 35”)的衰老棉叶, 用蒸馏水清洗干净, 60 ℃烘干至恒重,用剪刀剪成宽 0.5 cm 左右的小叶片, 放在保鲜袋中, 20 ℃保存备用。其基本化学性质如表 1。土壤基质采自南京林业大学树木园, 没有种植过转基因抗虫棉, 风干, 过 2 mm 筛备用; 牛粪采自南京环境科学研究所试验专用牛粪, 其基本理化性质见表 2。
1.2供试蚯蚓
试验蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eisenia foetida), 来自南京环境科学研究所的试验用蚯蚓。收集的蚯蚓在实验室培育一段时间后, 选取带有生殖环带、大小较一致的健康蚯蚓, 用蒸馏水冲洗干净并在滤纸上吸干水分, 称重(约为 0.20~0.40 g), 将其放在测试基质表面, 即可用于正式试验。
1.3试验设计
设 5 个处理: 100 g 牛粪+500 g 土壤(对照)、50 g转基因抗虫棉叶+550 g 土壤、100 g 转基因抗虫棉叶+500 g 土壤、50 g 非转基因抗虫棉叶+550 g 土壤、100 g 非转基因抗虫棉叶+500 g 土壤, 重复 3 次。各处理分别用 CK、50T、100T、50NT 和 100NT 表示。称取 500 g(或 550 g)土壤置于高 15 cm、直径 13cm、总体积约 2 L 的培养瓶中, 加少量水, 放入高压灭菌锅中灭菌杀死土壤基质中的有机体, 冷却后按设计加入牛粪(已灭菌)和棉叶, 混匀, 用去离子水调节水分至土壤最大持水量的 30%。在每个培养瓶中各放入健康蚯蚓 10 条, 用纱布扎好瓶口, 将培养瓶置于温度为(20±2)℃、湿度为 80%~85%的培养箱内,试验过程中不提供光照。为了研究转基因抗虫棉对蚯蚓的长期影响, 试验过程中约每 2 个月添加 1 次棉叶, 其添加量为原始加入量的 1/2。在试验过程中, 每隔 14 d 检查培养瓶中蚯蚓条数、卵数、重量(小心清除蚯蚓体表泥土), 检查完毕后全部放回原来的培养瓶中。等有第 2 代蚯蚓出现时(42 d), 开始随机采 1 条蚯蚓, 以后每隔 2 个星期(分别在 56 d、70 d、84 d、98 d、112 d 和 201 d)随机采 1 条蚯蚓, 采集的蚯蚓称重后放入装有 2 mL0.86%冷生理盐水的 5 mL 离心管中, 存于冰箱冷冻以测定 SOD 酶活性。
1.4SOD 活性测定
按每 0.1 g 生物量加 0.9 mL 0.86%冷却过的生理盐水, 制成 10%匀浆液。在 2 ℃、3 000 r•min 1条件下离心 12 min, 取上清液, 用南京建成生物工程研究所提供的超氧化物歧化酶试剂盒和考马斯亮兰蛋白试剂盒测定上清液中的 SOD 活性。
1.5数据处理
利用 Microsoft Excel 软件、DPS 数据处理系统软件的 Duncan新复极差法(简称 DMRT法)进行各处理间的差异显著性检验(P<0.05)。
2结果与分析
2.1急性毒性试验
转基因抗虫棉叶和常规棉叶喂养蚯蚓试验过程中, 于第 14 d 和第 28 d 检查培养瓶中蚯蚓的生长情况, 记录蚯蚓的死亡数据(数据未列出)。结果表明,本试验中作为对照的牛粪处理蚯蚓个体在 28 d 内无一死亡, 这说明本试验的条件比较可靠。与对照处理的结果一样, 50NT、100NT、50T 和 100T 处理的蚯蚓在 28 d 内均未出现致死现象, 这说明即使是高剂量的抗虫棉叶片, 也不会对蚯蚓产生急性毒杀效应。
2.2转基因抗虫棉叶对蚯蚓生长与生殖的影响
在转基因棉花未对蚯蚓产生毒杀效应的前提下,进一步开展转基因棉花对蚯蚓的生长和生殖影响的试验。不同时期蚯蚓平均体重的变化状况如图 1。从图1可以看出, 对照处理(无棉叶加牛粪)与其他处理有所不同, 在喂养前 28 d 内, 蚯蚓体重增加21.28%; 但之后一直下降, 试验结束时下降到原始体重的 34.04%。50T 与 50NT 处理的蚯蚓在喂养 14d 后, 净体重增加 10.0%, 而 100T 和 100NT 处理的净体重增加 20.0%; 之后, 50T 与 50NT 处理的蚯蚓净体重变化趋势一致, 试验结束后蚯蚓的体重与原始体重相差不大; 100T 除在 201 d 出现急速下降(降幅为 23.8%)外, 与 100NT 处理的变化趋势一致, 蚯蚓净体重一直处于上升趋势。在整个培养期内, 蚯蚓净体重总的变化趋势是 100T 和 100NT 高于 50T和 50NT, CK 最低, 可能与添加棉叶的量、食物的适口性(棉叶和牛粪的区别)等原因密切相关。转基因抗虫棉叶和常规棉叶喂养蚯蚓后, 不同时期蚯蚓生殖状况的变化如表 3 所示。在喂养 201 d的过程中, 各处理的蚯蚓茧数目在 1~16 个范围内;喂养 14 d 对照处理的蚯蚓茧数显著低于其他处理;28 d 对照处理的蚯蚓茧数显著低于 100NT, 与其他处理差异不显著; 除 50T 喂养 56 d 外, 喂养 42 d 后各处理的蚯蚓茧数没有显著差异。各处理中新产生的小蚯蚓数目随喂养时间的延伸有增加趋势。喂养前 28 d 内, 各处理间均未发现新产生的小蚯蚓, 直到 42 d 后才开始发现; 而 100T和 100NT 处理在喂养 56 d 后才检查到小蚓出现,100T 处理小蚯蚓数第 56 d、70 d 和 84 d 显著低于50T 和 50NT 处理, 但与 CK 及 100NT 处理没有显著差异。之后各处理间没有显著差异, 但 100T 处理有低于其他处理的趋势。
2.3转基因抗虫棉叶对蚯蚓体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
由图2所示, 在试验前期(前70 d), CK处理SOD活性高于其他处理, 42 d 时显著高于 50T 和 50NT 处理, 56 d 和 70 d 时显著高于其他处理; 84 d 后, CK 处理的 SOD 活性趋于降低, 201 d 时 CK 处理的 SOD活性显著低于 50NT 处理。50T 处理的 SOD 活性 56d 时显著低于 50NT 处理, 84 d 时显著高于 50NT 处理, 其他时期 50T 与 50NT 处理 SOD 活性无显著性差异。100T 和 100NT 处理蚯蚓体内的 SOD 活性变化趋势与 50T 和 50NT 处理相同。培养 98 d 后, 50T和 50NT 处理 SOD 活性有增加的趋势, 而 100T 和100NT 处理则相反。在试验结束时 50T 和 50NT 处理 SOD 活性显著高于 100T 和 100NT 处理。
3讨论与结论
28 d 的室内培养试验表明, 高含量的抗虫棉叶对蚯蚓没有急性毒杀效应。在 201 d 的蚯蚓喂养试验中, 与喂养非抗虫棉叶相比, 喂养 50 g 和 100 g抗虫棉叶(50T和100T)在126 d内对蚯蚓的体重无显著影响, 但在 201 d 时, 100T 处理蚯蚓的体重相对前一次大幅度下降; 这与 Zwahlen 等[16]的研究结果相一致, 其主要原因可能是转基因植物不但改变了土壤中微生物群落结构[19], 而且影响到转基因植物中化学成分的组成结构[16,20]。例如, Saxena 等[20 21]发现转基因玉米维管束鞘及厚壁组织细胞中含有更高含量的木质素, 这可能减慢凋落物的分解速率, 也有可能向蚯蚓提供低质量的食物, 从而不利于其生长生殖, 但更长时间的喂养试验及转基因植物叶片成分组成等数据的获得还需要进一步的研究。
喂养 14 d 对照处理的蚯蚓茧数显著低于其他处理; 28 d 对照处理的蚯蚓茧数显著低于 100NT, 与其他处理差异不显著; 除 50T 喂养 56 d 外, 喂养 42 d 后各处理的蚯蚓茧数没有显著差异。各处理直到 42 d 才开始发现新产生的小蚯蚓, 100T 和 100NT 处理直到56 d 才检查到小蚯蚓, 100T 处理 56 d、70 d 和 84 d 的小蚓数显著低于 50T 和 50NT 处理, 但与 CK 和100NT 处理没有显著差异。56 d 后其他处理间没有显著差异, 但 100T 处理有低于其他处理的趋势, 可能是由于高剂量的抗虫棉叶片对蚯蚓的生殖有抑制作用[17], 但尚需要更多的数据支持。
超氧化物歧化酶(SOD)是一种含有金属元素的活性蛋白酶, 广泛分布于各种生物体内, 如动物、植物、微生物等。SOD 具有特殊的生理活性, 是生物体内清除自由基的首要物质, SOD 在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标。现已证实,由氧自由基引发的疾病多达 60 多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害, 并及时修复受损细胞, 复原因自由基造成的对细胞的伤害[22]。生物体内 SOD 含量不是恒定的, 当生物所生存的环境出现逆境时, 生物体内会诱导 SOD 的产生。反过来说如果 SOD 活性越低, 生物生存的环境越理想[23]。本试验中, 除 56 d 和 84 d 外, 其他时期同等剂量抗虫棉叶和非抗虫棉叶对蚯蚓体内SOD活性的影响不显著。但是在试验结束时, 50T 和 50NT 处理的 SOD 活性显著高于 100T 和 100NT 处理。