重组人促卵泡激素促排卵药效学研究
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摘要：目的 通过观察重组人促卵泡激素对正常大鼠超排卵作用及对不排卵模型大鼠的排卵影响，研究rhFSH对大鼠的药效学作用。方法 ①超排卵实验，正常雌性大鼠后期开始皮下注射rhFSH，给药剂量15IU/kg/d，连续3d，前期给HCG10IU/只；②受孕实验，给药同上，前期给予HCG后将雌性大鼠与雄性大鼠合笼；③无排卵模型实验，幼年雌性SD大鼠注射外源雄激素制造不排卵模型，用rhFSH治疗15d。结果 rhFSH对正常大鼠的血清促性腺激素水平没有明显的抑制，rhFSH明显增加正常大鼠的黄体数和卵泡数目和受孕大鼠的胎鼠数（与正常组相比，P
关键词：排卵；大鼠；药效学
重组人促卵泡激素（Recombinant human follicle-stimulating hormone， rhFSH）是将带有重组后人促卵泡激素（hFSH）基因的质粒共转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），经过培养表达生产的。它是目前人类辅助生殖技术中常用的药物。由于糖基化作用的原因，原核表达系统难以生产出rhFSH。迄今为止，全球仅有两家公司的rhFSH 药物上市。对于动物的rhFSH药效学研究没有系统的报道，我们根据其临床的主要适应症设计了三个实验对其药效学作用进行系统的研究。对于超排卵作用方面，通过超排卵实验和受孕实验两个实验来进行研究，对于无排卵作用方面，通过rhFSH对雄激素致无排卵大鼠模型的作用实验来进行研究。为重组人促卵泡激素的可靠药效学评价建立基础。
1材料与仪器
1.1实验动物 雌性SD大鼠，体重200～250g；雄性SD大鼠，体重250～300g；9日龄雌性SD大鼠；均由中山大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为：SCXK（粤）2011-0029。
1.2药物与试剂 重组人促卵泡激素（rhFSH， Gonal-FR），生产厂家：默克雪兰诺有限公司，批号A0002920；0.9% 氯化钠注射液（NS），广东艾希德药业有限公司生产，生产批号：121027207；HCG，杭州动物药品厂， 批号12010；丙酸睾酮注射液，上海通用制药有限公司，批号111104；甲醛，广州化学试剂厂，生产批号：20120703，规格：AR，500ml/瓶；水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号：20120111，规格：250g/瓶；FSH、E2、LH、P、T激素检测化学发光试剂盒均为雅培贸易（上海）有限公司产品。
1.3主要仪器 光学显微镜成像系统：LEICA，DM5000B；全自动化学发光检测系统，Abbott雅培公司，型号：ARCHITECT i2000 sr；电子天平：METTLER TOLEDO，SB32000。
2实验方法
2.1促排卵实验
2.1.1超排卵试验 30只成年雌性SD大鼠按体重随机分为空白对照组、rhFSH组每组15只，各组大鼠体重分布相似。通过阴道涂片法确定雌性大鼠的周期。周期为5d，分为间期（2d），前期，期和后期。从后期开始给药，空白对照组皮下注射生理盐水（NS）1ml/kg/d，给药组皮下注射rhFSH 15IU/kg/d（根据临床推荐剂体表面积折算成大鼠的剂量），1次/d，连续注射3d，第4d（前期）皮下注射HCG10IU/只（有类似黄体生成素的作用，与FSH合用，可诱发排卵），第5d（期）上午对大鼠进行10%水合氯醛腹腔麻醉，腹腔静脉取血3ml，用于检测生化指标。处死后摘除卵巢，称重用Bouin氏液固定，常规脱水，包埋，石蜡切片，每隔6μm做连续切片，用于HE染色观察卵巢组织形态学指标。
2.1.2受孕实验 动物分组及给药方法同"2.1.1"，并于第4d（前期）皮下注射HCG10IU/只后，将雌性大鼠与健康成年雄性大鼠1：1合笼，次日观察数（以观察到有或有阴道栓的为判断标准），记录数，已的继续饲养12d后处死，分离子宫，记录受孕数，计算受孕率；分离受孕大鼠子宫，记录胚胎数，计算受孕胎鼠数。
2.2不排卵模型的治疗作用
2.2.1造摸 参照魏美娟，俞瑾方法，9d龄，其中16只由颈背部一次性皮下注射中性茶油0.05ml为正常对照组；剩余35只由颈背部一次性皮下注射丙酸睾酮1.25mg/只，为造模动物组。第70d龄阴道开口，连续阴道涂片两个动情周期。正常对照组动物连续阴道涂片应呈现典型动情周期（动情前期、动情期、动情后期、动情间期），将动情周期不典型者剔除；而造模动物组动物的阴道上皮细胞应无动情周期变化，呈持续性角化，提示无排卵大鼠模型制作成功，将未成功者剔除。经过两个动情周观察正常对照组有1只动情周期不典型剔除，造模动物成功率90.8%。
2.2.2给药 第81d龄后，正常对照组大鼠15只，按1ml/kg/d皮下注射给予蒸馏水，将成功无排卵大鼠模型动物，按体重随机分为2组模型对照组16只、rhFSH组16只，模型对照组大鼠按1ml/kg/d皮下注射给予生理盐水；rhFSH组大鼠按15IU/kg/d给予rhFSH。给药结束后，各组大鼠均连续阴道涂片两个动情周期，以判断大鼠排卵情况。
2.2.3取材 各组大鼠于动情周期前期时。再取子宫、卵巢、肾上腺、垂体、组织称重，子宫、卵巢、肾上腺计算脏器指数，并均选取左侧的卵巢和子宫组织标本置10%中性甲醛中固定，常规脱水，包埋，石蜡切片，每隔6μm做连续切片，用于HE染色观察卵巢组织形态学指标。
3结果
3.1正常大鼠超排卵实验结果
3.1.1血清性激素激素影响 结果由表1所示，rhFSH组与空白对照组相比，正常雌性大鼠期血清性激素（FSH、E2、P、LH）水平无统计学差异（P>0.05），提示在本研究剂量下rhFSH对正常大鼠期血清性激素水平没有明显的抑制作用。
3.1.2卵巢组织形态学 大体观察可见两组大鼠卵巢组织均色泽鲜红边缘光滑，卵泡细胞结构均较规则，与空白对照组相比，rhFSH组卵巢体积较空白对照组略大；光镜下观察rhFSH组卵泡颗粒细胞层数较空白对照组明显增多；与空白对照组相比，rhFSH组大卵泡数目和小卵泡数目有显著性增加差异（P
3.1.3受孕胎鼠数影响 大体观察，两组大鼠胚胎发育程度都较均匀；与空白对照组相比，rhFSH组可明显增加雌性受孕大鼠胚胎数（P0.05），提示rhFSH可明显促进卵泡的超排卵作用，见表3。
3.2 不排卵模型实验结果
3.2.1血清性激素影响 与正常对照组比较，无排卵模型组大鼠各激素水平均显著差异改变（P
3.2.2 脏器指数 子宫指数、卵巢指数、肾上腺指数、垂体重量变化，与正常对照组相比，模型对照组的子宫体指数和卵巢体指数显著降低（P0.05）。肾上腺指数和垂体重量未见明显差异（P>0.05），见表5。
3.2.3 卵巢病理形态学 大体观察可见正常对照组卵巢体积较大色泽鲜红，模型组卵巢萎缩色泽苍白，rhFSH组卵巢体积较模型组大，可观察到部分大鼠卵巢色泽呈粉红色；光镜下观察正常组卵泡颗粒细胞排列整齐，层数较多有较多黄体组织，模型组卵泡颗粒细胞排列不规则，几乎无黄体组织，rhFSH组卵泡颗粒细胞排列较整齐颗粒细胞层数较模型组增加，黄体组织较模型组增加；与正常对照组相比，模型组动物的次级卵泡、成熟卵泡和黄体数量明显减少（P
4讨论
促性腺激素（gonadotropin，Gn） 药物促排卵在不孕症治疗与人类辅助生殖技术实施中具有重要的地位。促性腺激素包括FSH、LH、HCG，FSH 及LH 是 主要参与卵泡生长发育的调控 ，特别是前者。目前含FSH的促性腺激素产品有HMG、uFSH、uFSH-HP 和rhFSH。而具有生物活性的FSH量明显高于HMG， 可有效避免内源性LH 过高或LH 峰提早出现， 提供更完善的生殖生理环境， 有利于改善子宫内膜容受性、促进优势卵泡发育， 获得高质量成熟卵母细胞。基因重组技术使纯化的FSH 用于临床，克服了尿源性促性腺激素中大剂量LH 及其他杂质的干扰，同时因其药物浓度的一致性，在体外受精联合胚胎移植技术（IVF）促排卵周期中较尿源性促性腺激素能获得足量优质卵子，临床上重组FSH也适用于治疗PCOS中克罗米芬无反应的患者。
本研究的超排卵实验结果显示rhFSH对正常大鼠的期血清性激素（FSH、E2、P、LH）水平影响没有明显影响，提示rhFSH对正常大鼠的促性腺激素分泌没有明显抑制；光学显微镜检查结果，rhFSH组的大卵泡数目和小卵泡数目显著增加；大鼠受孕实验中rhFSH组受孕大鼠的胚胎数明显增加。提示rhFSH对正常大鼠的超排卵作用。卵泡发育过程中， 卵泡刺激素（FSH）是重要的调控激素，通过外源性激素的注入，提高血液中激素浓度，降低发育卵泡的闭锁，增加早期卵泡发育到成熟卵泡的数量，从而使雌性动物每次排卵数目增加。它在卵泡早中期给于超越窦卵泡所需求的阈值， 募集更多的卵泡达到多个卵泡发育的目的， 并可以刺激颗粒细胞的细胞色素P450 和芳香化酶的表达。雄激素弥散入颗粒细胞周围， 并通过芳香化酶的作用转化为雌激素， 足够雌激素的产生对于成功受精和着床是必须的。黄体生成素（LH）主要作用于晚卵泡期，直接调控卵泡的成熟，促进雄激素的合成， 刺激卵泡膜的17-a 羟化酶的活性。卵巢颗粒细胞在卵泡中晚期才表达LH 受体， 此时与FSH 共同作用， 促进卵泡的发育。
本实验进行的rhFSH对大鼠无排卵动物的促排作用研究，采用动物模型是雄激素致不孕大鼠（ASR）模型，该大鼠成年后表现为高雄激素、低促性腺激素、无排卵和多囊卵巢等此模型无排卵，卵巢多囊性改变与人PCOS相似外，血清激素水平也符合人PCOS。本研究结果显示模型组血清性激素水平FSH、E2、P、LH显著低于正常对照组，而睾酮水平明显高于正常对照组，呈现高雄激素血症状，它是PCOS的重要特征之一；阴道涂片检查显示模型组无动情周期变化，提示无卵泡排出；光学显微镜下卵巢组织学检查显示模型组卵泡呈囊性扩张，少见卵母细胞与卵丘，几乎无黄体，与文献报道一致。与模型组相比，rhFSH组大鼠血清促卵泡激素、雌性激素水平有明显的提高，子宫指数和卵巢指数均有增加的趋势，次级卵泡、成熟卵泡和黄体数目均明显增加，提示rhFSH对PCOS无排卵大鼠卵泡发育有一定的促进作用。
综合以上，研究较为系统的评价了rhFSH对大鼠的促排卵作用，包括大鼠超排卵作用和对PCOS无排卵大鼠的促排卵作用，结果表明rhFSH对正常动物有明显的促排卵作用，提高受孕率；对不排卵模型动物的卵泡发育也有明显的促进作用。
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