高效液相色谱―荧光衍生法快速测定地沟油中的长链脂肪醛

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摘 要 本研究利用地沟油精炼过程中会产生醛类化合物的特点， 以O（3（9H咔唑9基）丙基）羟胺为荧光衍生化试剂， 采用高效液相色谱法测定己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛5种长链脂肪醛来鉴别地沟油及食用油中是否掺杂地沟油。 10 μL待测油样品溶于200 μL异丙醇， 在最佳条件下与O（3（9H咔唑9基）丙基）羟胺反应生成稳定的衍生物， 乙腈萃取后进样分析。以乙腈水（90∶10， V/V）为流动相， 在λex /λem=292 nm/348 nm下荧光检测， 衍生物在C18柱上15 min内可完全分离。检测5种脂肪醛的线性范围均为0.01～1.00 μmol/L， 检出限为0.05～0.10 nmol/L， 加样回收率为95.6%～101.4%。待测油样品的测定结果表明， 食用油基本不含上述5种脂肪醛， 而精炼地沟油中5种脂肪醛含量显著增加， 因此5种脂肪醛含量可作为检测地沟油的指标。本方法专属性强、灵敏度高、准确性好＼，方便＼，快捷， 可用于快速检测地沟油。

关键词 地沟油； 长链脂肪醛； 荧光衍生化； 高效液相色谱法

1 引 言

地沟油是各种劣质油脂的通称， 狭义的地沟油是指从宾馆、酒店、食堂等场所的餐厨垃圾中分离回收并加以提炼的油脂， 是地沟油中数量最大、危害最严重的一种[1]。这种油脂由于来自污水等各种垃圾污染的环境中， 附带很多有毒有害物质， 食用后会对人体健康造成巨大的威胁， 因此快速有效地鉴别地沟油越来越受到重视[2，3]。目前， 地沟油鉴别的常规指标有酸值[4]、碘值[5]和过氧化值[6，7]和辣椒素[8]等， 但地沟油经过精炼后， 这些指标均符合现行食用油标准， 且不法商贩会将精炼地沟油以一定比例添加入食用油中， 降低成本的同时可使各项检测指标符合要求， 给分析检测工作带来更大的困难。因此， 研究人员开发了基于不同原理的地沟油检测方法， 例如： 康莉等[9]利用气相气谱质谱联用的方法测定特征脂肪酸； 李军涛等[10]用免疫荧光层析法检测黄曲霉毒素B1； 赵琴等[11]用LCMS/MS测定辣椒素， 但上述方法多针对特定来源的地沟油， 易导致误判。

废弃油脂中多含有植物油， 植物油的主要成分为油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸， 它们在地沟油分离、精炼过程中会发生各种化学反应， 继而产生醇、酸、醛、多环芳烃等物质。其中脂肪醛类化合物被确定存在于地沟油中[12，13]， 基于此原理研究者开发了许多鉴别地沟油的方法， 例如董树清等[14，15]、沈卫阳等[16]以2，4二硝基苯肼（DNPH）为衍生化试剂检测粗制地沟油、精炼地沟油中的短链脂肪醛， 陈振贺等[17]也采用DNPH为衍生化试剂， 测定餐饮油烟中的15种短链的醛酮， 为地沟油中脂肪醛类物质的检测提供了一种可行的方法。然而以DNPH为衍生化试剂时灵敏度不高， 且上述方法测定的是在地沟油精炼过程中由于挥发造成含量降低的短链脂肪醛类物质， 使结果不准确。曹文明[18]等指出， 不饱和脂肪酸在加热时会发生脂质过氧化反应产生壬醛、癸醛等长链脂肪醛， 这些长链脂肪醛不易挥发， 且随着加热时间延长会逐渐累积， 更适于作为地沟油鉴别检测的指标。因此， 本研究以O（3（9H咔唑9基）丙基）羟胺[19]作为荧光衍生化试剂， 测定了食用油和地沟油样品中的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛这5种长链脂肪醛， 结果显示， 新开封食用油基本不含这5种长链脂肪醛， 而在地沟油中含量较高。 此方法灵敏度高、专属性强， 可实现对地沟油或掺有地沟油的食用油的鉴别。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪（脱气机、四元泵、荧光检测器， 美国Agilent公司）； TS100恒温混匀仪（杭州瑞诚仪器有限公司）； TGL16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）； ZLS2真空离心浓缩仪（湖南赫西仪器装备有限公司）。

己醛（≥99.0%）、庚醛（≥ 98%）、辛醛（99%）、壬醛（96%）、癸醛（97%）标准品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； O（3（9H咔唑9基）丙基）羟胺衍生化试剂为实验室自制[19]； 其它试剂均为色谱纯或分析纯。食用油样品： 某品牌压榨葵花籽油（20160814）、某品牌玉米油（20160712）、某品牌玉米胚芽油（20161016）、某品牌葵花籽油（20160727）为超市购得。地沟油样品： 于中国药科大学食堂收集的废弃油脂参考文献[14～17]中的方法精炼而得， 2016.11.08食堂一楼采集精炼得地沟油1样品， 2016.11.09食堂二楼得地沟油2样品， 2016.11.11食堂三楼得地沟油3样品。

2.2 溶液的配制

己醛标准溶液的配制： 取适量己醛标准品溶于甲醇， 配制成浓度为2.0 mmol/L的储备液， 将储备液稀释20倍， 得0.10 mmol/L的己醛标准溶液。

混合脂肪醛标准溶液的配制： 取适量的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛标准品， 溶于甲醇， 配制成浓度各为2.0 mmol/L的混合醛储备液， 将储备液稀释20倍， 得0.10 mmol/L的混合醛标准溶液。

O（3（9H咔唑9基）丙基）u胺衍生化试剂溶液的配制： 取24.0 mg的衍生化试剂， 溶于甲醇， 配制成10 mmol/L的储备液， 将储备液稀释10倍， 得1.0 mmol/L的衍生化试剂溶液。

以上溶液储均存于20℃的冰箱待用中， 每月更换。

2.3 液相色谱条件

色谱柱为Kinetex EVOC18柱（100 mm×4.6 mm， 2.6 μm， 广州菲罗门科学仪器有限公司）， 柱温30℃； 流动相为乙腈水（90∶10， V/V）， 流速0.4 mL/min； 荧光检测条件： 激发波长为 292 nm， 发射波长为 348 nm。

2.4 衍生化反应过程

O（3（9H咔唑9基）丙基）羟胺与脂肪醛类化合物的反应原理见下式：

其中， 酸为该反应的催化剂。反应产物包括cis和trans两个异构体， 在本实验的色谱条件下， cis和trans两个异构体合并为一个色谱峰， 这有利于脂肪醛含量的测定。以己醛为例， 衍生化过程如下： 取10 μL 0.10 mmol/L己醛标准溶液与10 μL 1.0 mmol/L衍生化试剂溶液， 加入100 μL 10 μmol/L Η3ΡΟ4调节酸度， 加水至总体积为1 mL， 混匀后将反应液置于恒温混匀仪上， 在600 r/min、 40℃条件下反应15 min， 反应完成后冷却至室温， 取10 μL进样分析。

2.5 供试油样的采集与处理

地沟油的采集与精炼： 参考文献[14～17]的方法， 将从食堂中收集到的餐厨垃圾中的上层油脂先用棉花过滤， 滤液加热至沸除去水分， 得粗制地沟油。在50 mL粗制地沟油中加入20 mL 1 mol/L NaOH， 油样迅速变混浊， 出现白褐色絮状物， 再加入10 mL 10% NaCl溶液静置过夜， 油样分层。取分层后的油样加入一定量活性炭， 置于115℃油浴中30 min后过滤得到金黄色透明的精制地沟油， 其外观与食用油基本一致。

超市购买的食用油无需前处理， 开封后直接取样， 进行衍生化反应。

2.6 食用油与地沟油样品的分析测定

取供试油样品10 μL， 分别加入异丙醇200 μL、 1.0 mmol/L 衍生化试剂溶液10 μL、 10 μmol/L Η3ΡΟ4溶液100 μL、 水180 μL充分振荡混匀， 置恒温混匀仪上在600 r/min、40℃条件下反应15 min。反应后的溶液用少量的乙腈萃取3次， 离心分层， 取上清液合并后挥干溶剂， 残留物用乙腈1 mL溶解， 0.45 μm微孔滤膜过滤， 取10 μL续滤液进样分析。以保留时间定性， 按试样峰面积与标准品峰面积比较进行定量。

3 结果与讨论

3.1 衍生化条件的优化

以己醛为代表， 分别考察了酸的种类和用量、衍生化试剂用量、反应温度和反应时间等条件对衍生化反应的影响。按2.4节操作， 保持其它条件不变， 分别以相同浓度（105 mol/L）的不同的酸作为催化剂， 衍生化产物的色谱峰面积见表1， 即以Η3ΡΟ4为催化剂时效果最好。保持其它条件不变， 以不同浓度的Η3ΡΟ4（102～106 mol/L）作为催化剂时， 衍生化产物随着Η3ΡΟ4浓度降低而增加， 但当浓度低于10 μmol/L时， 衍生化产物开始减少（图1A）， 因此选择最佳的Η3ΡΟ4浓度为105 mol/L。同理， 在保持其它条件不变的条件下， 确定了衍生化试剂与脂肪醛的浓度比为10∶1（图1B）、反应温度为40℃（图1C）、反应时间为15 min（图1D）为最佳条件。

3.2 方法学考察

3.2.1 线性关系与检出限、进样精密度、重复性实验 取0.10 mmol/L混合醛标准溶液， 依次稀释为75， 50， 25， 10， 5.0， 1.0 μmol/L， 各取10 μL， 加入浓度分别为混合醛溶液浓度10倍的衍生化试剂溶液50 μL、10 μmol/L Η3ΡΟ4 100 μL、异丙醇200 μL， 加水至总体积为1 mL， 充分振荡混匀， 置恒温混匀仪上在600 r/min、40℃条件下反应15 min， 分别得到浓度为1.0， 0.75， 0.50， 0.25， 0.10， 0.05， 0.01 μmol/L的标准混合醛衍生反应液， 各取10 μL进样分析。取线性关系中0.01 μmol/L标准混合醛衍生反应液按稀释法操作， 按信噪比3∶1测定各脂肪醛的检出限。取0.10 μmol/L标准混合醛衍生反应液， 按上述色谱条件连续进样6次， 测定进样精密度。取10 μL地沟油1样品， 按照2.6节方法处理样品进行5次平行实验， 测定重复性。实验结果见表2。各脂肪醛在0.010～1.00 μmol/L的浓度范围内线性关系良好， 检出限（S/N=3）在0.05～0.1 nmol/L之间， 进样精密度和重复性良好。

3.2.2 加标回收率 取10 μL某品牌压榨葵花籽油（20160814）， 分别精密加入20 μmol/L混合醛标准溶液10 μL， 平行做6份， 另取未加混合醛标准溶液的该品牌压榨葵花籽油（20160814）10 μL同时进行衍生化反应， 按2.6节方法处理， 将衍生物用1 mL乙腈溶解， 取10 μL进样测定， 计算加标回收率， 结果见表3， 各脂肪醛的加样回收率在95.6%～101.4%之间。随着碳链增长， 加样回收率逐渐降低， 可能是由于碳链增长后， 在油脂中的溶解度增大， 萃取效率降低所致。

3.3 供试油样品分析

取地沟油1、地沟油2、地沟油3、某品牌压榨葵花籽油、某品牌玉米油、某品牌玉米胚芽油、某品牌葵花籽油各10 μL， 按照2.6节方法处理并进行分析， 典型色谱图见图2， 含量测定结果见表4。

由图2可见， 与混合醛标准溶液色谱图（图2A）比较， 新开封食用油中只含有O微量的己醛（图2B）， 可能是灌装过程中混入少量氧气导致亚油酸过氧化生成的。开封后的食用油随着接触空气量增加， 过氧化反应不断进行， 己醛和壬醛（来自油酸的过氧化）含量逐渐升高（图2C）。地沟油中己醛和壬醛的含量显著高于新开封食用油（图2D、2B）， 与开封一段时间的食用油比较， 除了己醛和壬醛含量明显增加外， 检出庚醛、辛醛和癸醛（图2D、2C）， 这可能是由于地沟油精炼过程中经过高温处理降解而产生的， 而未经高温处理的食用油仅含有极少量的己醛和壬醛。对不同时间、不同地点采集的餐厨垃圾中的油脂进行精炼所得的地沟油和超市购买的不同品牌、不同生产时间的食用油的测定结果见表4， 结果表明， 购买的食用油中仅含极微量的己醛， 而地沟油中均含有己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛这5种长链脂肪醛， 且己醛和壬醛显著高于新开封食用油和已开封一段时间的食用油。但对于掺有地沟油的已开封食用油， 以己醛和壬醛含量判别其是否为地沟油可能出现误判。由表4可知， 利用供试油样品中是否含有庚醛、辛醛和癸醛可判断其是否为地沟油， 按表4的测定结果即使以1∶10比例将地沟油掺入食用油仍可检测到庚醛、辛醛和癸醛（浓度远高于检出限）。由此可见， 本研究通过测定长链脂肪醛可实现对地沟油和掺有地沟油的食用油的鉴别， 为地沟油的鉴别提供了一种新的方法。

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