耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同源性分析及耐药性研究
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[摘要] 目的 对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）进行耐药情况和分子流行病学监测，探讨院内MRSA的流行趋势。方法 收集我院2009年1月～2011年6月临床标本分离的MRSA菌株60株；采用 Microscan WalkAway 40进行菌株鉴定，同时对所有金黄色葡萄球菌进行药物敏感性分析；采用脉冲场凝胶电泳技术对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行分子分型。结果 共收集60株MRSA菌株，其中17株被认为是可疑社区获得（CA-MRSA），43株被认为是医院获得（HA-MRSA）。所有菌株均对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、呋喃妥因和奎奴普丁/达福普汀敏感，未出现耐药菌株。CA-MRSA与HA-MRSA对左旋氧氟沙星和利福平的敏感性有明显差异。临床分离的MRSA菌株PFGE分型较为分散，共分为13种型别，每种型别的菌株数分别为2～6株不等，未出现大范围的院内流行克隆。结论 本院收集的临床分离的MRSA菌株多重耐药性严重，其中CA-MRSA相对HA-MRSA敏感性稍高。所有金黄色葡萄球菌未出现糖肽类抗菌药物耐药。MRSA菌株未出现大范围的院内流行株，但仍应加强院内感染流行控制。
[关键词] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；社区获得性；医院获得性；药物敏感性；脉冲场凝胶电泳
[中图分类号] R378.1+1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）07-0084-04
自20世纪60年代英国检出世界上首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），随后各国MRSA发生率逐渐上升，至80年代后期MRSA已成为医院院内感染的重要病原菌，占医院分离的金黄色葡萄球菌的80%以上[1，2]。MRSA常对多种抗菌药物呈现耐药，并可通过接触途径进行传播，从而引起传播流行，故世界各国均将MRSA的流行情况作为长期监测的重点[3，4]。我院于2009年底开始出现MRSA克隆株的流行，为了解MRSA分子流行克隆的耐药性，探讨本院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行株及其分布特点，本研究对临床非重复分离的60株MRSA进行分子分型，为院内感染的防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
2009年1月～2011年6月自衢州市人民医院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌60株，剔除重复菌株。所有菌株用滤纸片法-70℃保存。
1.2 试剂与仪器
西门子德灵公司MicroScan WalkAway-40全自动微生物鉴定仪进行鉴定，药敏纸片选用英国OXOID公司产品，限制性内切酶ApaⅠ购自TaKaRa宝生物工程大连有限公司，溶葡萄球菌素、高密度琼脂糖和低熔点琼脂糖、溶菌酶、蛋白酶K购自生工生物（上海） 公司，Marker沙门菌Braendebrup血清型H9812由杭州邵逸夫医院俞云松教授惠赠。CHEP-MAPPER 脉冲电泳仪、Universal HoodⅡ型凝胶成像仪均为BIO-RAD 公司产品，DK-8D型电热恒温水槽购自上海精宏公司，Rotamax 420摇床为Thermo公司产品。
1.3 分离鉴定及药敏试验
将从临床采集的合格标本中分离的可疑菌落行革兰染色、触酶试验、血浆凝固酶试验，并用WalkAway-40全自动细菌鉴定仪鉴定并检测各菌株对常用抗菌药物的敏感性，同时用头孢西丁纸片扩散法及苯唑西林MIC法筛选MRSA菌株。严格按照标准操作程序进行。判断标准参照CLSI 2010年版；质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213。
1.4 CA-MRSA的筛选
参照Fridkin等[5]建议依据临床资料筛选CA-MRSA，即从门诊或入院48h内分离收集的MRSA，且该患者近期无长期住院病史。符合上述条件的将被可疑为CA-MRSA临床株。
1.5 MRSA临床菌株的PFGE
参照文献[6]，细菌的包埋；细胞壁的裂解；蛋白酶K消化；内切酶对细菌DNA的消化；加样及电泳；凝胶成像仪下观察结果，拍照。
1.6 PFGE条带的解释
通过目测判定其带型之间的关系，采用Tenover 等[7]提出的标准进行分型。酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，可认为是同一型别；由于突变、插入、缺失或倒置的遗传改变导致1～3条条带有差异，可认为是紧密相关，定为亚型；带型中4～6条条带有差异为可能相关，可认为是不同型别；7个或更多个条带有差异，可认为在流行病学上无相关性。
1.7 统计学方法
对CA-MRSA 组与HA-MRSA 组对抗菌药物的敏感性进行统计学分析，采用χ2检验，P
2 结果
2.1 HA-MRSA和CA-MRSA对抗菌药物的耐药率
依据临床资料对60株MRSA进行筛选，获得17株疑似CA-MRSA（28.33%）及43株HA-MRSA（71.67%）。HA-MRSA和CA-MRSA对抗菌药物的耐药率比较详见表1。
表1 CA-MRSA与HA-MRSA对抗菌药物的耐药率比较（%）
2.2 60株MRSA临床分离株经PFGE分型
成功分型48株，型别共13种，命名从A型～M型（图3），其中A型3种亚型共6株，B型2种亚型共5株，C型2株，D型2株，E型6株，F型4株，G型2种亚型共6株，H型2株，I型2种亚型共2株，J型5株，K型2株，L型3株，M型3株。这13种型别均有4条或4条以上电泳条带不同，可认为无同源关系的散发克隆。同一型别菌株有不超过3条电泳条带差异，可认为是同源克隆。部分PFGE结果见图1。
图1 MRSA部分临床菌株PFGE电泳图
1～13为MRSA临床菌株，M为沙门菌Braendebrup血清型H9812
从成功分型的48株MRSA菌株型别来看，这批菌株的同源分型较为分散，没有典型的院内流行克隆株，相对较多的A型、E型、G型菌株数也只有6株，其他分型的菌株数均不超过6株。HA-MRSA菌株在每种型中均有出现，其中B型和G型的HA-MRSA菌株较多。CA-MRSA分布在7种型当中，其中A型出现3株，E型出现5株。
2.3 PFGE不同型别在3年时间内的变化趋势
本研究收集MRSA菌株时间为2009年1月～2011年6月，期间每年分离到的MRSA菌株数逐年上升， 2009年分离12株，平均月分离菌株仅1株，2010年分离26株，平均月分离菌株达到2.2株，而2011年上半年就分离到22株，平均月分离菌株达到3.7株。PFGE的分型结果显示，克隆分型数有逐年增多的趋势，2009年出现5种分型，到2010年分型数就达到了9种， 2011上半年也已达到9种，那些新出现的分型应引起特别重视。B型和E型两种分型3年时间均有出现，应加强对这种长期流行克隆的监测工作。见图2。
图2 PFGE不同型别在3年时间内的变化趋势
3 讨论
MRSA已成为医院感染的重要病原菌之一[8]，感染多见于有严重基础疾病、免疫功能低下并使用侵入性操作和广谱抗生素者[9]。本研究中， HA-MRSA占分离MRSA中的71.67%（43/60），说明院内感染仍是最主要的MRSA菌株来源，因此，为控制MRSA的院内感染，做好隔离、消毒措施，合理使用抗生素，严格执行医院感染控制制度是十分必要的[10]。Cepeda等[11]的研究早已证实，加强隔离等预防措施可有效切断MRSA的传播、降低其感染率。CA-MRSA占所有MRSA菌株的28.33%，高于章锐锋等报道的15.3%[12]，低于温洪伟等报道的42%[13]，这可能与地域性和患者来源有关。从药敏结果分析，所有MRSA菌株对所有β内酰胺类抗生素高度耐药，对大环内酯类、克林霉素类和四环素类等抗菌药物的耐药率>50.0%，而对万古霉素、呋喃妥因、奎奴普汀/达福普汀、利奈唑胺和替考拉宁完全敏感。所以，万古霉素仍是治疗MRSA所致严重全身性感染的首选药物，奎奴普汀/达福普汀、利奈唑胺和替考拉宁可作为万古霉素治疗效果欠佳时的备选药物，而呋喃妥因目前仅用于治疗下尿路感染性疾病。另外，我们还发现，在对左氧氟沙星和利福平的敏感性上两组菌株有明显差异，CA-MRSA的敏感性高于HA-MRSA，这与一些报道不完全相符，可能与不同地区存在不同的抗菌药物的选择压力有关。
为了解感染源头、传播途径以及克隆株中占主导地位的菌株类型，对怀疑MRSA流行株进行流行病学研究是十分必要且是遏制其爆发流行的关键，为此人们开发了很多种流行病学监测的手段，目前MRSA分子流行病学监测的方法主要有脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）、金黄色葡萄球菌A 蛋白基因（spa）分型、葡萄球菌染色体mec耐药盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）分型、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等[14]。PFGE 是建立在限制性内切酶多态性分析基础上的分型技术，具有分辨率高、费用相对较低等特点，常用于短时间、小范围的流行病学调查[15]。本研究所进行MRSA的分子流行病学调查范围局限在医院内，因此采用PFGE的方法可以清晰明确地反映院内菌株的流行克隆特点。PFGE分型电泳条带相差1～3条，可认为是同一克隆型菌株。从PFGE分型的结果来看，院内分离60株MRSA没有出现大规模的流行克隆，PFGE所分的型别较散，共有A型～M型13种，每种型别菌株数最多也仅为6株，有4种型别存在2种以上的亚型。HA-MRSA在各种型别上均有分布，没有显著性的差异，CA-MRSA由于菌株数较少而分布在7种型别，其中A型和E型菌株数较多，但没有明显集中趋势。MRSA菌株的流行在院内有逐年增多的趋势，在所有分离到的60株MRSA菌株中，2009年分离12株，平均月分离菌株仅1株，2010年分离26株，平均月分离菌株达到2.2株，而2011年上半年就分离到22株，平均月分离菌株达到3.7株。PFGE的分型结果显示，克隆分型数也有逐年增多的趋势，对一些长期出现的同源克隆分型，应加强监测，采取切实可行的院感控制工作。
MRSA很有可能通过医护工作人员的手及鼻腔传播给患者，或者在使用侵入性医疗器械时发生交叉感染。因此，加强医护人员的感染控制观念，利用精确、可靠且分辨率强的分型技术加强MRSA感染监控至关重要。
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（收稿日期：2013-11-11）