铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因的克隆与表达分析

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[摘要]锌铁调控转运蛋白（ZRT， IRT-like protein， ZIP）在植物生长发育过程中起重要的调控作用。

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1.5实时定量PCR分析分别用2 μg根、茎、叶样品总RNA反转录合成cDNA，EF1a为内参基因^[16]，qPCR分析DoZIP1基因的组织表达模式。引物为qPCR-F （5′-CGGGCTTCATCCACATACT CC-3′）和qPCR-R（5′-AACTATTCCCACCTCCAACACC-3′）的扩增产物长347 bp。用ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems， USA）进行扩增。反应体系25 μL包括2× SYBRR Premix Ex TaqTM Master Mix （Takara， China） 12.5 μL，正反向引物（10 μmol・L^-1） 0.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9 μL。每个反应重复3次，包括不加模板的对照，实验重复3次。PCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40个循环，反应结束绘制溶解曲线。根据ABI PRISM 7500 SDS软件（Applied Biosystems， USA）生成的循环阈值（Cycle threshold， CT），用2-ΔΔCt法^[17]计算相对表达量。

2结果与分析

2.1DoZIP1基因的克隆分析2次巢式5′-RACE扩增获得长度约为1.1 kb的目标条带（图1）。因为R2-nest下游引物跨原EST的终止密码子，该目标产物应该系基因全长。克隆、测序和拼接分析获得了一条1 100 bp的cDNA，BLASTx分析显示其与GenBank已注册的植物ZIP基因一致性为56%～64%。其包含的ORF长1 056 bp，5′-UTR长31 bp，3′-UTR长13 bp，起始密码子附近序列AAAATGA符合KOZAK规则^[18]，表明已成功获得基因全长，命名为DoZIP1，提交GenBank获得注册号KJ946203。

1.5′RACE扩增产物; M .DL 2 000相对分子质量标准。

2.2DoZIP1蛋白的理化特性推定的DoZIP1蛋白含Leu最多，为47个（13.4%），其次是Ala，Gly和Ile，均为33个（9.4%），其他氨基酸数目在6.0%～0.9%，如Phe为20个（5.7%），Thr为17个（4.8%），Trp仅3个，占0.9%。Protparam预测其分子式为C1727H2732N436O468S15，含351个氨基酸，等电点（pI）6.09，相对分子质量37.57 kDa，正电残基（Arg+Lys）21，负电残基（Asp+Glu）27，不稳定系数36.13，脂肪系数高达119.77，亲水性系数0.610。ProtScale分析结果显示，DoZIP1蛋白疏水性最大值为3.456，亲水性最高值为-3.211，且在较多位置上均表现出疏水性，说明其是1个疏水性蛋白质。

2.3DoZIP1蛋白的二级结构、结构域和保守基序分析SOPMA预测结果显示（图2），DoZIP1蛋白二级结构共有α螺旋（alpha helix， 50.71%）178处，随机卷曲（random coil， 36.18%）127处，延伸链（extended strand， 11.11%）39处以及β转角（beta turn， 1.99%）7处;α螺旋和随机卷曲为二级结构的主要元件，分散于整个蛋白质中。

InterProScan分析表明，DoZIP1蛋白含有锌铁调控转运相关蛋白结构域（42～348），以及1个典型的保守基序（HSVIIGLSLGA，209～219）。PROSITE SCAN分析表明DoZIP1蛋白含有数目不等的功能基元，包括2个N-糖基化位点（104～107，326～329）、3个蛋白激酶C磷酸化位点（42～44，225～227，287～289）、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（22～25，184～187）、8个N-肉豆蔻酰化位点（87～92，180～185，214～219，241～246，243～248，272～277，276～281，295～300）和1个酰胺化位点（34～37），这些基元可能对蛋白的结构和功能具有重要的作用。

2.4DoZIP1蛋白亚细胞定位、信号肽和跨膜域预测PSORT预测DoZIP1蛋白定位在质膜的可能性最高为64%，定位于高尔基体几率为46%，定位于内质网膜为37%，内质网腔为10%。SignalP4.1预测分析DoZIP1蛋白含1个信号肽（1～24），为分泌蛋白。TMHMM分析结果显示（图3），DoZIP1蛋白具有8个跨膜区（5～22，42～64，76～98，120～142，197～219，261～283，290～311，326～348），位于第4，5个跨膜域间的可变区处于胞内，说明该基因编码蛋白很可能为膜定位蛋白。

2.5DoZIP1和其他植物ZIP蛋白的多序列对比运用DNAStar 5.0中的MegAlign程序对DoZIP1蛋白和已知植物ZIP蛋白进行多序列对比分析。DoZIP1与葡萄（Vitis vinifera， XP_002264621）、柑橘（Citrus sinensis， XP_006481378）、毛果杨（Populus trichocarpa， XP_002307860）、蓖麻（Ricinus communis， XP_002527722）和水稻（Oryza sativa， Q7XLD4）等植物ZIP蛋白的一致性分别为61.8%，61.5%，61.3%，60.4%，50.1%（图4）。

2.6DoZIP1与拟南芥、水稻ZIP家族蛋白的进化关系下载具有代表性的拟南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa ZIP家族蛋白氨基酸序列，使用MEGA 4.0 软件邻接法（Neighbour-joining， NJ）构建系统进化树（图5）。结果显示，DoZIP1蛋白与ATIRT1，AtZIP8，OsZIP3，AtZIP10聚成一个分支，与OsZIP3，AtZIP10的亲缘关系较近。

2.7基因表达模式分析分别提取铁皮石斛根、茎、叶等样品总RNA，利用实时定量基因扩增荧光检测系统（QPCR）技术检测基因表达模式。DoZIP1基因在3种组织中为组成型表达，相对表达量有明显差异，转录本在根中相对表达量较高（图6），为茎中的4.19倍，叶中次之（1.12倍）。

3讨论

锌铁调控转运蛋白通过介导Zn2+，Fe2+，Mn2+，Cd2+等2价阳离子的转运，调节胞内离子稳态，在植物生长发育过程中起重要调控作用。关于植物ZIP基因的系统性研究主要来自拟南芥^[5]、苜蓿^[6]、菜豆^[7]、玉米^[8]、大麦^[9]和水稻^[10]等重要模式植物或者作物，尚未见到药用植物ZIP基因的相关报道。植物ZIP通常呈多基因家族，各成员之间协同作用控制着植物对微量元素的高效吸收和利用。铁皮石斛生于海拔约1 600 m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的特殊环境，生长缓慢，极难存活，野生资源濒危^[13]。鉴定铁皮石斛ZIP家族基因并研究其生物学功能，揭示特殊生长环境下微量元素高效利用的生理机制，将为道地药材形成的分子机制和高产优质品系的培育提供理论依据。因

此，本研究利用RACE技术分离到1个铁皮石斛锌铁调控转运蛋白编码基因DoZIP1，并分析了编码蛋白理化特性、结构域、跨膜域、亚细胞定位以及进化关系等生物信息学特征。

DoZIP1与多种植物ZIP基因一致性较高，编码蛋白有ZIP家族的保守结构域和多个基序，其氨基酸数（351个）介于植物ZIP蛋白氨基酸数309～476^[8]，可变区亦富含结合金属离子的组氨酸残基，这些符合植物ZIP的序列特征^[4]。DoZIP1蛋白包含信号肽和跨膜域，系膜蛋白，印证了PSORT的质膜定位分析，和其他植物ZIP蛋白的膜定位特性一致[2，4]。同一基因家族的不同成员一般包含相似序列和功能结构域，执行类似的生物学功能^[19]。DoZIP1与OsZIP3，AtZIP10处于ZIP系统进化树的同一分支上、亲缘关系较近，OsZIP3受缺锌条件诱导参与水稻对锌的吸收^[10]，DoZIP1蛋白应该具有相类似的作用。植物对矿质元素的吸收主要在根中进行，细胞利用离子通道、转运子等蛋白通过质外体或共质体策略介导矿质元素的吸收、转运和分配，调控植物的生理适应和生长发育^[6]。实时定量PCR分析结果显示DoZIP1基因在石斛根中表达丰度较高，因此推测该基因可能在石斛根中发挥转运微量元素的生理作用。当然，DoZIP1基因究竟在微量元素转运过程的怎样起作用，石斛ZIP基因家族其他成员与其功能有何差异，是否存在相互作用，这些有待于进一步深入研究。

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