心肺复苏干细胞移植后肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的表达

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DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.10.007

基金项目：国家自然科学基金（30700303）；国家级临床重点专科建设项目

通信作者：黄子通，Email：

【摘要】目的

探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对心肺复苏（CPR）大鼠脑肿瘤坏死因子×诱导蛋白6（TSG-6）表达的影响。方法 SD大鼠随机（随机数字法）分为假手术组（Sham组）、磷酸盐缓冲液注射组（PBS对照组）和MSCs移植组。通过窒息法诱导大鼠心搏骤停后进行CPR，复苏后2 h，PBS对照组和MSCs移植组分别静脉注射PBS与MSCs。CPR后1 d、3 d和7 d，对各组大鼠进行神经功能缺损评分（NDS），酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清S-100B，免疫荧光检测MSCs在脑内分布和TSG-6的表达，实时RT-PCR检测脑组织TSG-6和促炎症因子的表达水平，Western blot检测脑组织中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）表达水平。组间比较采用方差分析。结果 CPR后3 d和7 d，MSCs移植组NDS均高于PBS对照组（P

【关键词】 心搏骤停；心肺复苏；间充质干细胞；炎症；神经功能缺损评分；S-100B；促炎症因子；肿瘤坏死因子α诱导蛋白6

Expression of tumor necrosis factor-α-induced protein 6 after transplantation of mesenchymal stem cells in a rat model of cardiopulmonary resuscitation Lin Qingming， Zhao Shen， Zhou Lili， Fang Xiangshao， Fu Yue， Huang Zitong. Institute of Cardiopulmonary Cerebral Resuscitation， Department of Emergency， Sun Yat-sen Memorial Hospital， Sun Yat-sen Universtiy， Guangzhou 510120， China

Corresponding author： Huang Zitong， Email： .cn

【Abstract】Objective To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells （MSCs） treatment on TSG-6 in a rat model of cardiopulmonary resuscitation （CPR）. Methods Sprague Dawley （SD） rats were randomly（random number） divided into sham group， phosphate buffer solution （PBS）-treated group and MSCs-treated group. Animals were subjected to asphyxial cardiac arrest followed by CPR. In PBS-treated group or MSCs-treated group， animals were injected intravenously with PBS or MSCs at 2h after resuscitation. Neurological deficit scores （NDS） were assessed at 1， 3 and 7 d after CPR. Serum S-100B was assayed using enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Immunofluorescence was performed to detect donor MSCs and the expression of TSG-6 in brain. TSG-6 and proinflammatory cytokines in brain were assayed using real time reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Western blot analysis was performed to measure the levels of neutrophil elastase （NE） in brain. Multiple comparisons were made by analysis of variance. Results At 3d and 7d， MSCs-treated group demonstrated higher NDS than PBS-treated group （P

【Keywords】Cardiac arrest； Cardiopulmonary resuscitation； Mesenchymal stem cells； Inflammation； Neurological deficit scores； S-100B； Proinflammatory cytokines； Tumor necrosis factor-α-induced protein 6

心搏骤停（CA）是全脑缺血最常见的病因，病死率高。心肺复苏（CPR）后缺血-再灌注损伤引起的脑损伤主要表现为全脑散在分布的缺血改变神经元，其中皮层和海马损伤最为明显[1]。08年研究表明，骨髓间充质干细胞（MSCs）移植可通过调控炎症和免疫反应减轻脑损伤并改善神经功能[2]。但是MSCs调控炎症反应的确切机制仍不明确。MSCs在促炎症因子诱导下可分泌一种抗炎症因子即肿瘤坏死因子α诱导蛋白6（TSG-6）[3]。提示MSCs移植后在体内缺血缺氧环境下可能通过分泌TSG-6调控炎症反应。因此，本文通过静脉输注骨髓MSCs后，观察CPR后全脑缺血大鼠脑组织炎症反应、脑损伤及神经功能变化，同时检测脑组织TSG-6表达，初步探讨MSCs移植对CPR大鼠神经功能的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 骨髓MSCs分离和培养

按文献[4]报道分离和培养大鼠骨髓MSCs。无菌条件下，取4～5周龄雄性SD大鼠4～6只（中山大学实验动物中心，合格证号：SCXK 2011-0029），分离其胫骨和股骨，用DMEM/F12培养基（Gibco，美国）反复冲洗骨髓腔以获取骨髓，收集细胞悬液后，常温下1500 r/min离心5 min。以含10%胎牛血清（Hyclone，美国）的DMEM/F12重悬细胞并接种在25 cm2培养瓶，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，24 h半量换液，3 d全量换液。7～9 d细胞生长至约90%融合时，用0.25%胰酶（Gibco，美国）消化并按1∶2比例进行第一次传代，后以同样方法培养并传代，本实验用第三代MSCs。按文献[5]报道用流式细胞仪鉴定MSCs，即CD45、CD11b阴性，CD29、CD44阳性。移植前按文献 [6]报道用4，6二脒基-2-苯吲哚盐酸（DAPI，罗氏，美国）标记MSCs并以0.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，细胞含量为5×106/0.5 mL。

1.2 动物分组与干预

10周龄体质量300～400 g雄性SD大鼠56只（中山大学实验动物中心，合格证号：SCXK 2011-0029）随机（随机数字法）分为PBS对照组和MSCs移植组。MSCs移植组（n=24）：自主循环恢复（ROSC）后2 h，通过右颈外静脉输注5×106/0.5 mL DAPI标记的MSCs。PBS对照组（n=24）：ROSC后2 h通过右颈外静脉输注等体积PBS。每组另设CPR后1 d、3 d和7 d 3个时间点，每个时间点8只大鼠。另设立假手术组（Sham组，n=8）：仅进行动静脉置管和气管插管等，未诱导CA。规定时间点处死大鼠，留取血清-80 ℃保存待测，亚组3只大鼠脑组织用于病理检测，5只大鼠脑组织-80 ℃保存备用。

1.3 窒息诱导大鼠心搏骤停及心肺复苏

术前禁食12 h，自由饮水。按45 mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉。直视下经口用14号套管（Abbocath-T，美国）行气管插管。从右颈外静脉置入23号PE-50聚乙烯管（Abbocath-T，美国）到右心房用于输液和MSCs移植，同样从左股动脉置入23号PE-50聚乙烯管到胸主动脉用于监测主动脉血压，所有导管均充满5 U/mL肝素生理盐水。用加热灯维持肛温在（36.5±0.5）℃，持续监测肛温。记录肢体Ⅱ导联心电图。数据记录在数据采集卡（Windaq采集系统，美国）。动物进行机械通气，吸入氧浓度为21%，潮气量为6.5 mL/kg体质量，呼吸频率100次/min。用呼气末二氧化碳检测仪（CAPSTAR-100，美国）测量峰值呼气末二氧化碳分压（PETCO2）。

窒息方法采用维库溴铵（1 mg/kg）停止呼吸[7]。以主动脉血压失去波动波形且平均动脉血压（MAP）降至20 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）以下作为CA判定标准，CA 6 min后开始以200次/min体外心脏按压和100次/min同步机械通气（心肺复苏机械装置，中山大学心肺脑复苏研究所），吸呼比1∶2，吸入氧体积分数100%，按压深度为胸廓前后径1/3，按压2 min后按0.005 mg/kg给予肾上腺素。ROSC定义为恢复室上性心律，MAP维持在60 mm Hg持续5 min以上。按压4 min后仍无ROSC，则放弃CPR。ROSC后持续通气2 h，大鼠有上呼吸道反射时，拔除所有导管。

1.4 神经功能缺损评分（NDS）

按文献[8]描述采用NDS评价CPR后神经功能缺损，检测由专人进行。NDS评分标准包括了对觉醒、脑神经反射、运动功能、简单的行为反射等多个方面的检测，得分范围从0～80分，0分为脑死亡，80分为脑功能正常。

1.5 血清S-100B检测

用大鼠S-100B特异ELISA试剂盒（华美，武汉）按说明书测定各组血清S-100B水平。

1.6 脑组织免疫荧光检测

4%多聚甲醛固定脑组织24 h后，分别用20%和30%蔗糖梯度脱水，冰冻切片机行10 μm厚连续冠状切片。切片先与正常兔血清孵育以封闭非特异性抗原，然后与羊抗TSG-6抗体（1∶100， Santa Cruz， 美国）4 ℃孵育过夜，最后与Cy3标记兔抗羊二抗（1∶100， 博士德，武汉）室温下孵育，荧光显微镜下观察DAPI阳性蓝色细胞和TSG-6阳性红色细胞并拍照。

1.7 实时RT-PCR

取皮层和海马各约50 mg，用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA。用PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂盒（Takara，大连）进行逆转录反应。用GoTaq qPCR Master Mix PCR试剂盒（Promega，美国）对目的基因cDNA进行实时扩增反应。目的基因引物序列分别如下：TSG-6 （178 bp） 上游5’-AAGCAGCCAGAAAGATTGGA-3’，下游5’-TTCGGGTTGTAGCAATAGGC-3’；白介素1β（IL-1β， 109 bp） 上游5’-TCCTCTGTGACTCGTGGGAT-3’，下游5’-TCAGACAGCACGAGGCATTT-3’；白介素6（IL-6， 142 bp） 上游5’-AGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3’，下游5’-AGCCTCCGACTTGTGAAGTG-3’；肿瘤坏死因子α（TNF-α， 128 bp） 上游5’-TCGTCTACTCCTCAGAGCCC-3’，下游5’-ACTTCAGCGTCTCGTGTGTT-3’；GAPDH （496 bp） 上游5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG -3’，下游5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。实时PCR反应条件：预变性95 ℃ 2 min，变性95 ℃ 3 s，退火60 ℃ 30 s。

目的基因mRNA相对表达量用2-ΔΔCt计算。

1.8 Western Blot

取皮层和海马各约50 mg，按RIPA试剂盒说明书（碧云天，上海）提取总蛋白并用BCA法测蛋白含量。将蛋白质量浓度调成3 μg/μL，样品按4∶l加入5倍上样缓冲液，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，其中分离胶10%，浓缩胶5%。蛋白电转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，并与兔抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体（1∶500，Abcam，美国）4 ℃孵育过夜，用含吐温 20磷酸缓冲液（TBST）洗涤，再与羊抗兔IgG-HRP（1∶1000，博士德，武汉）常温下孵育1 h，ECL试剂显色、曝光，用BandScan 5.0图像处理软件扫描并分析。

1.9 统计学方法

用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。正态分布数据用均数±标准差（x±s）表示，非正态分布数据用中位数表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis H检验，两两比较用Bonferronni’ post hoc检验。重复测量数据组间比较采用重复测量方差分析，以P

2 结果

2.1 大鼠心搏骤停前基线指标

Sham组、PBS对照组和MSCs移植组间基线指标具有可比性。见表1。

2.2 神经功能缺损评分（NDS）

CPR后PBS对照组大鼠均存在神经功能缺损，尤其在CPR后1 d（P0.05）。CPR后3 d和7 d，MSCs移植组NDS均高于PBS对照组（P

2.3 血清S-100B水平

CPR后PBS对照组大鼠血清S-100B水平显著升高（P0.05）。CPR后3 d和7 d，MSCs移植组血清S-100B水平均显著低于PBS对照组（P

2.4 MSCs在脑组织分布及TSG-6的表达

CPR后1 d、3 d和7 d，荧光显微镜下可见MSCs移植组DAPI标记的MSCs细胞核呈圆形或卵圆形，大部分细胞不规则分布在皮层及海马。PBS对照组未见DAPI标记的MSCs。TSG-6免疫荧光显示细胞浆呈红色。双标免疫荧光显示有些DAPI标记的细胞可见红色细胞浆，表明MSCs迁移到缺血损伤的脑组织并表达TSG-6。见图1。

2.5 脑组织TSG-6 mRNA表达

CPR后，PBS对照组大鼠皮层TSG-6 mRNA表达水平均高于Sham组（P0.05）。CPR后3 d和7 d，MSCs移植组大鼠皮层TSG-6 mRNA表达水平均明显高于PBS对照组（P

2.6 脑组织NE表达

CPR后，PBS对照组大鼠皮层NE表达水平均高于Sham组（P0.05）。CPR后3 d和7 d，MSCs移植组大鼠皮层NE表达水平均低于PBS对照组（P

2.7 脑组织促炎症细胞因子表达

CPR后，PBS对照组大鼠皮层IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平均高于Sham组（P0.05）。CPR后3 d和7 d，MSCs移植组IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平均低于PBS对照组（P

3 讨论

本研究表明，CPR后全脑缺血大鼠脑组织炎症反应明显，脑损伤及神经功能障碍明显，静脉MSCs治疗3 d后明显抑制脑组织炎症反应，减轻脑损伤并改善大鼠神经功能。此外，MSCs治疗3 d后脑组织TSG-6表达明显升高，双标免疫荧光显示，一些迁移到脑组织的MSCs也表达TSG-6。因此，MSCs治疗后TSG-6表达升高与脑组织炎症反应抑制、脑损伤减轻及神经功能改善密切相关，MSCs可能通过分泌抗炎症蛋白TSG-6抑制炎症反应、减轻脑损伤并改善神经功能。 CA和CPR引起脑损伤的病理生理机制包括CA完全性短暂全脑缺血与CPR期间及CPR后继发性炎症反应[9]。缺血后神经炎症反应的特征是炎症介质表达升高，尤其是促炎症细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α可加强脑缺血损伤后神经炎症反应，引起血脑屏障破坏及后续脑水肿的发展[10]。许多研究报道，脑缺血后以促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α升高为标记的炎症反应参与了脑损伤，用药物降低促炎症因子水平后可减轻神经元损伤并改善神经功能[11-13]。NE是一个相对分子质量为33 000的丝氨酸蛋白水解酶，以生物活性形式储存于中性粒细胞的初级颗粒内。白细胞及其释放的NE在脑缺血后炎症中起关键作用。最近研究表明，脑缺血后脑组织NE表达水平明显升高，用NE抑制剂治疗后明显减轻脑水肿[14]。S-100B为中枢神经损伤的特异性标志物，是判断脑损伤程度和预后的客观指标[15]。与以上研究一致，本实验结果显示，CPR后全脑缺血大鼠脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α明显升高，NE升高，同时血清S-100B水平明显升高，提示CPR后大鼠脑组织炎症反应及脑损伤明显；MSCs治疗3 d后明显降低这一系列促炎症因子水平及NE水平，同时降低S-100B水平，减轻脑炎症反应，减轻脑损伤。

骨髓MSCs是重要的组织工程种子细胞。近年来，MSCs抗炎症作用已引起研究者极大兴趣，MSCs是调控炎症的一类重要保护细胞。体内研究表明，给予外源性MSCs可减轻包括急性心肌梗死[3]、角膜炎[16]、腹膜损伤[17]和肺损伤[18]等动物模型的炎症反应，其机制是MSCs增加抗炎症因子水平从而降低促炎症因子水平。这些抗炎症因子包括TSG-6、前列腺素E2（PGE2）、白介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）和斯钙素-1，其中TSG-6尤其引起人们重视[19]。本实验也观察到MSCs治疗3 d后脑组织TSG-6表达明显升高，一些迁移到脑组织MSCs也表达TSG-6；同时脑炎症反应和脑损伤减轻，神经功能得到改善。这些现象表明MSCs治疗后，TSG-6可能有助于抑制CPR后大鼠脑组织炎症反应、减轻脑损伤并改善神经功能。当然，要证实这种因果关系，下一步实验需要通过输注TSG-6抗体或siRNA技术阻断TSG-6表达。在本研究中，MSCs治疗的疗效在移植后3 d才开始出现，推测可能是MSCs迁移到脑损伤区需要一段时间才能发挥其抗炎症效果。

总之，MSCs治疗3 d后明显抑制CPR后大鼠脑组织炎症反应，减轻脑损伤并改善大鼠神经功能；MSCs可能通过分泌TSG-6抑制炎症反应、减轻脑损伤并改善神经功能。

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（收稿日期：2014-05-17）

P1098-1104