注射型磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶作为BMP注射性载体的可行性研究

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作者：刘通方,刘建,孟国林,袁志,吕荣,毕龙,王登虎,刘艳武,胡蕴玉

【关键词】 注射剂；磷酸钙类；骨粘合剂；纤维蛋白组织粘着剂；骨形态发生蛋白质类；载体；骨诱导

【Abstract】 AIM: To evaluate the feasibility of injectable calcium phosphate cement (ICPC) and fibrin sealant (FS) as an injectable compound carrier of bone morphogenic protein (BMP) . METHODS: The composites of ICPC/FS/bBMP, ICPC/FS or bBMP were injected subcutanously or implanted into thigh muscle pouches of 45 mice at random.The effect of ectopic bone formation was evaluated by biochemical examination of alkaline phosphatase (ALP) and histological examination 2 and 4 weeks after operation and the new bones were weighed in the 4th postoperative week to compare statistically the ability of bone formation of different composites. RESULTS: ICPC/FS/bBMP composite induced the formation of new bone most effectively. BBMP stimulated cess osteogenesis while ICPC/FS showed no sign of new bone formation.There was a significant difference among them (P<0.05). CONCLUSION: The injectable bone substitute, ICPC/FS/BMP, exhibited an excellent osteoinductive activity,and ICPC/FS was a good carrier for BMP.

【Keywords】 injectio; calcium phosphates; bone cements; fibrin tissue adhesive; bone morphogenetic proteins; carrier; osteoinduction

【摘要】目的： 了解以注射型磷酸钙骨水泥(ICPC)/纤维蛋白胶(FS)共同作为骨形态发生蛋白(bmp)复合载体的注射型骨修复材料在小鼠体内异位成骨的能力，探讨其作为注射性骨替代物的可行性. 方法： 在小鼠肌袋随机注射或植入ICPC/FS/bBMP复合物、ICPC/FS复合物和单纯bBMP材料，术后2 wk, 4 wk取材，通过碱性磷酸酶测定和组织学检查，观察其异位诱导成骨能力. 并对术后4 wk时新生骨进行定量测定和统计学比较. 结果： ALP和组织学检查结果表明ICPC/FS/bBMP复合物有较多新骨形成，单纯bBMP诱导出少量骨，ICPC/FS复合物未见新生骨，诱导骨量有统计学意义（P<0.05）. 结论： 可注射性ICPC/FS/BMP复合物具有良好的骨诱导活性，ICPC/FS是BMP的良好注射性载体之一.

【关键词】 注射剂；磷酸钙类；骨粘合剂；纤维蛋白组织粘着剂；骨形态发生蛋白质类；载体；骨诱导

开放植骨是植骨术的传统方式，但近年来随着微创伤外科技术的发展,研制和应用可注射性骨替代材料已成为一个重要的努力方向［1-2］. 注射型磷酸钙骨水泥（injectable calcium phosphate cement, ICPC）具有良好的生物相容性和根据骨缺损形状临时塑性的特性，使其成为目前最具潜力的植骨材料之一. 但其空隙率低，降解缓慢，影响新骨的长入［3-4］. 而纤维蛋白胶（fibrin sealant, FS）不仅具有良好的止血、粘结功能和可注射性,而且生物相容性良好、易于被人体吸收, 是骨形态发生蛋白（bone morphogenic protein, BMP）的理想载体［5-6］,已广泛用于许多外科领域. 我们以研制具有骨诱导、可塑形和能降解的注射型骨移植材料为目标，在ICPC中加入降解快的FS，组成注射型复合载体，可望提高ICPC的降解速度，加速新骨的生长.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1以ICPC/FS为bBMP复合载体的注射型骨修复材料的合成干燥bBMP（第四军医大学骨科研究所综合骨库提供）称质量后剪成碎块,浸泡于FS（广州倍绣生物技术有限公司提供）的生物胶主体溶解液中,4℃温度下放置24 h,玻璃匀浆器研磨成混悬液. 再与生物胶主体相溶，制成BMP/主体胶混悬液；另将催化剂与催化剂溶解液相溶，制成催化剂溶液. 将二者放在双腔推液器中备用. 将ICPC（上海瑞邦生物材料有限公司提供）按固液比为100 g/40 L的质量体积比，用搅拌器混合成膏状后，立即用双腔推液器同时加入相同体积的bBMP/主体胶混悬液和催化剂溶液. 二者按各自凝固后的体积比为2∶1的比例均匀混合. bBMP在生物胶主体溶解液中的浓度，为使每个肌袋模型中植入的材料约含bBMP 5 mg.

1.1.2实验动物分组及处理一级昆明小鼠45只，4周龄，雌雄不限，体质量18~22 g（第四军医大学实验动物中心提供）. 按植入材料不同随机分为3组： ICPC/FS/bBMP组、ICPC/FS组和bBMP组. 小鼠常规麻醉消毒. 将ICPC/FS/bBMP组和ICPC/FS组材料各0.5 mL注射到小鼠右大腿肌袋内;另将bBMP组材料 5 mg经小鼠右大腿后外侧直切口植入肌袋内, 缝合肌膜层及皮肤. 放回笼内分组饲养. 术后2 wk各处死5只小鼠,术后4 wk各处死10只小鼠，均在右大腿取材.

1.2方法

1.2.1大体观察术后观察小鼠饮食、活动和切口反应情况,取材后注意有无炎性反应,材料有无排出以及成骨情况.

1.2.2碱性磷酸酶(ALP)检测术后2 wk和4 wk各处死5只小鼠，把标本表面的软组织剔除,然后将标本用利刀分成两半,一半标本用于ALP检测,另一半用于组织形态学检查. 采用ALP试剂盒(南京建成生物研究所)检测ALP.

1.2.3组织形态学观察标本常规固定包埋切片后行HE染色,光镜观察. 主要观察炎症反应,成骨和材料的降解情况.

1.2.4BMP成骨活性测定术后4 wk各组另处死5只小鼠，将材料连同周围肌肉一同取出，彻底清除骨痂表面软组织以及残余材料. 并计算4 wk时各组单位剂量bBMP的成骨活性，检测ICPC/FS是否能够提高bBMP的成骨活性.

统计学处理： 数据以x±s表示，ALP活性测定结果采用两因素方差分析, BMP成骨活性测定采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1大体观察各组小鼠均无死亡,饮食、活动正常,伤口均正常愈合. 术后1~4 wk, ICPC/FS/bBMP组和bBMP组植入区有半圆形包块形成,触之较韧,包块逐渐增大变硬.

2.2ALP活性测定每个实验组各测定5份标本，取平均值. 术后2 wk和4 wk时，ALP水平由高到低依次为： ICPC/FS/bBMP组bBMP组ICPC/FS组，ICPC/FS/bBMP组和ICPC/FS组间差异有统计学意义（P<0.05），而ICPC/FS/bBMP组和bBMP组间差异无统计学意义(表1).表1ALP检测结果(

2.3组织形态学观察术后2 wk： 各组植入区可见有少量炎性细胞浸润，周围肌组织基本正常. ICPC/FS/bBMP组(图1)中FS已大部分吸收，可见间充质细胞增殖、聚集，并被由间充质细胞分化来的软骨样细胞和软骨样组织分割包绕ICPC；bBMP组（图2）有散在的小软骨岛形成. ICPC/FS组（图3）见较多团块状残余材料，以ICPC为主，FS部分吸收，无软骨细胞形成. 术后4 wk： ICPC/FS/bBMP组（图4）软骨细胞和软骨组织逐渐成熟，新骨形成. 残余材料内FS已完全吸收，ICPC材料被进一步分割，降解，呈现空泡化，其内部有细胞长入. bBMP组（图5）可见少量交织骨、骨小梁，并有少量红骨髓. ICPC/FS组（图6）仍有较多团块状材料残留，其周围见纤维组织增生,未见新骨形成.

2.4BMP的成骨活性测定术后4 wk时, ICPC/FS/bBMP组的BMP成骨活性是bBMP组的1.5倍,差异有统计学意义(P<0.05, 表2).表2术后4 wk时新骨量测定(

3讨论

ICPC［3-4］和FS［5-7］只具有骨传导作用而没有骨诱导能力已经被大量的实验所证实. 骨传导作用是利用植入材料的支架作用使宿主骨以爬行替代的方式修复骨缺损，这种方式的成骨不可能在肌肉环境中进行. 因而目前多采用肌袋异位诱导成骨模型对植入材料的骨诱导活性进行评价. 本研究将ICPC/FS复合后植入小鼠肌袋内未见软骨和骨形成，4 wk后材料被纤维组织包裹，表明ICPC/FS复合后仍无骨诱导能力.图1ICPC/FS/bBMP组术后2 wk： ICPC内可见大量的结缔组织和间充质细胞HE ×100

图2bBMP组术后2 wk： 在小鼠大腿肌肉组织间有软骨细胞形成HE ×100

图3ICPC/FS组术后2 wk： 见较多团块状材料，无软骨细胞形成HE ×100

图4ICPC/FS/bBMP组术后4 wk： 大量的新骨形成，ICPC材料降解明显HE×100

图5bBMP组术后4 wk： 少量的骨形成HE ×100

图6ICPC/FS组术后4 wk： 未见新骨形成,仍有较多团块状材料残留HE ×100

BMP的主要生物作用是诱导未分化的间充质细胞向软骨和骨的方向分化，其促进成骨作用的发挥依赖于与适宜的载体缓释系统结合, 否则极易被体液稀释转运, 或被迅速降解［8］. 磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement, CPC）对多种药物有缓释作用［9-10］，但将CPC直接用作BMP的载体，在国内外报道很少，更未见CPC与BMP的注射使用，其主要原因可能是BMP与CPC的复合过程中很容易损伤其分子立体结构，进而影响骨诱导作用的发挥. 同时由于BMP的分子量较大，不利于释放. 我们首先将BMP与FS复合，是因为FS是一种研究和应用较多的BMP缓释载体［5-7, 11］，是BMP的理想保护剂，对于增强BMP的稳定性，延长释放时间具有明确的效果［11-12］. FS天然的网状微观结构有助于BMP的附着和BMP与靶细胞接触,其强大的粘着力有利于BMP的缓慢释放. 另外，随着FS的快速降解,在植入材料的周围可形成BMP的浓度梯度,增加了BMP与靶细胞作用的时间［7,12］；同时，使复合材料的空隙率逐渐增加，为新骨的形成和血管长入提供了有效的立体空间,反过来也加速了ICPC自身的降解. 本实验证实了上述设想：将ICPC/FS/bBMP注射在小鼠肌袋内2 wk时可见间充质细胞增殖、聚集，并被由间充质细胞分化来的软骨样细胞和软骨样组织分割包绕ICPC；4 wk时软骨细胞和软骨组织逐渐成熟，大量新骨形成. ICPC材料呈现空泡化，其内部有细胞长入. 反映了随着材料的降解，新骨逐步长入ICPC材料内的趋势. 4 wk时BMP活性，定量地说明了ICPC/FS/bBMP组新骨形成量明显优于单纯bBMP组. 另外，ICPC/FS/bBMP组AKP含量明显升高，而bBMP组AKP只轻度升高,也从生化角度反映了新骨的形成［13］. 总之,以ICPC/FS为载体复合BMP的注射型骨修复材料在充分发挥FS对BMP 缓释作用的同时, 又使载体获得了良好的机械性能. 具有明确的骨诱导能力、制备简单、能注射使用等突出优点.

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