高效液相色谱法测定复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量
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摘 要：本文采用高校液相测定了复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量，固定相为：安捷伦Cl8（4.6mm×250mm，5um），乙腈-水（23∶77）（用冰醋酸调pH至3.85）为流动相，检测波长为346nm，流速1.0mL・min-1，柱温：30℃。黄芪苷在50～500μg・mL-1范围内呈良好的线性关系。黄芪苷的平均回收率为99.5%，RSD为0.73%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量测定。
关键词：复方黄芪颗粒；黄芪苷；含量
黄芪为复方黄芪颗粒主要成分之一。黄芪具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。黄芪常用于气虚乏力，便血崩漏，表虚自汗，食少便溏，久泻脱肛，痈疽难溃，久溃不敛，中气下陷，血虚萎黄，内热消渴等。但食积停滞，表实邪盛，气滞湿阻，痈疽初起或溃后热毒尚盛等实证，以及阴虚阳亢者，均须禁服黄芪。《药品化义》记载："若气有余，表邪旺，腠理实，三焦火动，宜断戒之。至於中风手足不遂，痰壅气闭，始终皆不加。"现在药理研究表明黄芪具有增强机体免疫功能、调节血压、抗病毒性心肌炎、增强造血功能、改善物质代谢、增强性腺功能、抗应激、延缓衰老、保肝、抗溃疡等作用[1-5]。黄芪临床常用于高血压病、缺血性心脏病、银屑病、糖尿病、幽门螺旋杆菌阳性胃溃疡、慢性鼻炎、急性肾小球肾炎、骨质疏松等。本文采用高校液相测定了复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量。
1 仪器与试药
HH-601超级恒温水浴（江苏金坛市亿通电子有限公司）；海能LC7000四元低压梯度系统（济南海能仪器股份有限公司）；屹谱仪器U-1810准双光束紫外可见分光光度计（屹谱仪器制造（上海）有限公司）；UV-6双光束扫描型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；舜宇恒平AE电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；Histoon Lab I-05实验室超纯水机（科尔顿（中国）有限公司）；10升数控型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）。黄芪苷对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（河南巴福斯化工产品有限公司）、乙醇（河南巴福斯化工产品有限公司）、磷酸（淄博丰仓化工有限公司）、甲醇（天津威赛诺科技发展有限公司）、冰醋酸（济南英出化工科技有限公司）、磷酸氢二钠（济南英出化工科技有限公司）、三乙胺（河南巴福斯化工产品有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果 ，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6 mm×250 mm，5um）；乙腈-水（23∶77）（用冰醋酸调pH至3.85）为流动相；检测波长为346nm。理论板数按黄芪苷峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取复方黄芪颗粒，研细，精密称取，加60毫升50%乙醇溶液超声处理0.5小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用50%乙醇溶液分次洗涤容器和残渣，洗液滤人同一量瓶中，加50%乙醇溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取黄芪苷对照品约5mg，用流动相溶解并稀释成每1ml中含200μg的溶液，作槎哉杖芤骸
2.4 阴性溶液的制备
依照处方取五味子、补骨脂、女贞子等，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在黄芪苷出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μg・mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，黄芪苷对照品在50～500μg・mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.3项下制备对照品溶液，精密吸取黄芪苷对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.76%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
称取同一批的复方黄芪颗粒样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.65%，结果表明此方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8小时精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品黄芪苷峰面积积分值的RSD为0.73%。结果表明黄芪苷至少在8小时内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的黄芪苷对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.5%，RSD为0.73%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定复方黄芪颗粒三批样品中黄芪苷的含量，含量为3.26mg/袋、3.16mg/袋、3.34mg/袋。
3 讨论
分别考察乙腈-水（23∶77）（用冰醋酸调pH至3.85），甲醇-水-冰醋酸（28∶72∶0.1），水-甲醇-三乙胺（60∶40：0.01），乙腈-0.08%磷酸溶液（20：80），磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠二水合物15.04g、磷酸氢二钠0.0627g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH值至4.5）一甲醇（70：30）不同比例的流动相，结果以乙腈-水（23∶77）（用冰醋酸调pH至3.85）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-水（23∶77）（用冰醋酸调pH至3.85）为流动相。此方法简便、准确、重现性好，可用于复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量测定。复方黄芪颗粒中黄芪苷的含量应为标示量的95%-105%。
参考文献
[1]黄芪注射液对新生儿缺氧缺血性脑病的临床与免疫学机制研究[J].卓名，陈鸿莲，蔡娜丽，张振英，叶国杰.中国中西医结合急救杂志.2008（01）
[2]黄芪注射液对血液透析患者氧化应激状态的影响[J].曲晓璐，戴芹，唐咏华，徐达华，吴中华，苑松荣，葛秀萍.中国中西医结合肾病杂志. 2008（01）
[3]黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖及再灌注后内皮细胞与中性粒细胞黏附的影响[J].陈立新，朱海燕，朱陵群，谢连娣，林钦，张颖.中国组织工程研究与临床康复.2007（27）
[4]黄芪多糖对浆细胞样树突状细胞功能及成熟的影响[J].刘立民，张彦明，陆沭华，孙雨梅，何广胜.中国免疫学杂志.2010（08）
[5]黄芪注射液对肾病综合征患儿血生化和免疫球蛋白的影响[J].林飞进，黄金城，崔敏娴.中国中西医结合肾病杂志.2008（01）