苹果、柑橘和梨中灭幼脲残留量测定及其在贮藏期间变化研究

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摘要 研究苹果、柑橘和梨中灭幼脲残留吸收与贮藏温度、储存时间的关系。苹果、柑橘和梨经灭幼脲溶液浸泡处理后在室温或冷藏条件下储存，然后定期进行液相色谱-串联质谱（LC-MS）测定。结果表明：方法回收率为87.86%～103.4%，检出限为0.06 ng/mL，定量限为0.2 ng/mL，线性范围为1～500 ng/mL，线性相关系数0.996，相对标准偏差RSD为2.2%～7.5%。苹果、柑橘和梨在室温条件下贮藏对灭幼脲的吸收高于低温，果皮灭幼脲残留水平随着储存时间的延长而下降，果肉残留水平随着贮藏时间先上升后下降且果皮的残留水平高于果肉。

关键词 水果；灭幼脲；电喷雾电离；液相色谱-串联质谱法

中图分类号 S481+.8 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0114-03

Abstract To study the relationship between the residual absorption of chlorbenzuron and storage temperature and storage time，the apples，oranges and pears with a dipping treatment were stored at room temperature or at 0～4 ℃，then chlorbenzuron residue levels with LC-MS/MS were determined.The average recoveries ranged from 87.86% to 103.4% with a RSD between 2.2 % to 7.5%.The results showed that the limit of detection and the quantitation limit was estimated to be 0.06 ng/mL and 0.2 ng/mL respectively under the optimal conditions，the linear ranges were 1～500 ng/mL while the relative coefficient was 0.996.The residue levels showed that less absorption at 0～4 ℃，and the residual level in peel decreased with the prolonging of storage time，while the residual level in pulp increased first and then decreased with the prolonging of storage time.The residual level in peel was higher than that in pulp.

Key words fruits；chlorbenzuron；electrospray ionization；LC-MS/MS

近些年，果农在防治苹果、柑橘、梨等果树的金纹细蛾、梨星毛虫、梨小食心虫、苹果舟蛾、卷叶蛾、柑橘木虱等害虫时使用剧毒农药，并加大药量和药次，不仅杀伤大量天敌，而且使得害虫的抗药性大大提高，形成恶性循环，无公害农药灭幼脲的成功研发在很大程度上解决了这个问题[1]。灭幼脲（chlorbenzuron），又名灭幼脲Ⅲ号、苏脲Ⅰ号、一氯苯隆，是1976年由江苏省激素研究所和苏州大学首先合成的一种苯甲酰脲类的杀虫剂，化学名称1-邻氯苯甲酰基-3-（4-氯苯基）脲，分子式C14H10Cl2N2O2，CAS号：57160-47-1，结构式如图1所示，它对哺乳动物无蓄积毒性[2]，易光解[3]，易被微生物降解[4-5]，是一种广谱、高效、高选择性、低毒低残留的绿色农药[6]，且对多种果树害虫的防治效果十分显著[7-8]。

目前，灭幼脲在苹果、柑橘中残留检测已有报道[9-10]，但并未见梨中灭幼脲残留的相关研究。且灭幼脲残留的检测气相色谱法（GC）和液相色谱法（HPLC）[10-12]较为常见，而采用液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测灭幼脲残留鲜见报道，与GC和HPLC相比，HPLC-MS/MS具有准确性高、灵敏度高、操作简单、检测快速等优点。国家标准（GB 2763-2014）规定了灭幼脲在谷物和蔬菜中的最高残留限量（MRL）均为3 mg/kg，但并未有水果的最高残留限量规定，本文采用液相色谱-串联质谱法对灭幼脲在苹果、柑橘和梨中的残留吸收和其在贮藏期间的变化规律进行研究，以为苹果、柑橘和梨3种水果中的安全残留量和贮藏方式提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

日本岛津公司的Shimadzu LC-20AD液相色谱系统（包括二元梯度泵、真空在线脱气机、柱温箱和自动进样器）；美国AB SCIEX公司的API 3200 Qtrap三重四级杆串联质谱仪（配置TurbolonS-prap离子源、HARVARD pumpⅡ针泵及安装Analyst软件的计算机）；日本资生堂的CAPCELL PAK C18色谱柱（规格：100 mm×2.0 mm×5 μm）；德国BRAUN公司的CombiMax K600型蔬菜粉碎机；德国IKA公司的T18型匀浆机；灭幼脲标准品（纯度为97.7%），购置于北京坛墨质检科技有限公司；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷均为进口色谱纯；氯化钠为分析纯；0.22 μm有机系滤膜；超纯水由美国Millipore公司的Milli-Q超纯水系统制备。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的制备。①标准储备溶液。准确称取0.100 0 g灭幼脲标准品，用丙酮定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL标准溶液，-20 ℃储藏备用。②标准工作溶液。取出100 μL 灭幼脲的标准储备溶液，用甲醇稀释至10 mL的容量瓶中，配制成10 μg/mL的标准工作溶液备用。③标准工作曲线。取10 μg/mL的标准工作溶液的标准工作溶液用甲醇稀释成浓度为0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000 μg/mL的系列标准溶液，依次进样测定，以定量离子色谱图中的峰面积进行定量，绘制标准曲线。

1.2.2 样品预处理方法。①样品制备。市场上购买新鲜苹果、柑橘和梨样品，分别用50 μg/mL的灭幼脲溶液浸泡2 min后自然风干，纸箱包装后分别在常温（15～25 ℃）和低温（0～4 ℃）下贮藏。每5 d制备1次待测样品，共制备5次，同时以同一批购买的未经浸泡的苹果、柑橘和梨样品作对照。制备样品时，取3个果实，苹果和梨削皮（约1 mm厚度），柑橘直接剥皮。果皮用蔬菜粉碎机粉碎，混匀；果肉可食部分切块，充分混匀后用四分法分样，然后粉碎机粉碎，每次每种水果的果皮和果肉均制备3个平行样。②样品提取与净化。称取样品10.0 g（精确到0.01 g）于100 mL离心管中，加入25 mL二氯甲烷-石油醚（1∶1），匀浆机高速匀浆2 min，10 000 r/min离心5 min，上清液转移至250 mL鸡心瓶中，残渣再加入25 mL二氯甲烷-石油醚（1∶1），重复提取，合并2次上清液，40 ℃水浴蒸发约至1 mL，氮气吹干，加入1 mL甲醇∶水（V∶V=1∶1）涡旋10 s，再加入1 mL正己烷，涡旋30 s，静置分层，取下层溶液过0.22 μm有机系滤膜后，待上机。

1.3 LC-MS/MS条件

1.3.1 色谱条件。色谱柱：CAPCELL PAK C18色谱柱（规格：100 mm×2.0 mm×5 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：10 μL；平衡时间0.5 min；流动相为甲醇∶水=25∶75（V∶V）。

1.3.2 质谱条件。电喷雾离子源正离子模式（ESI+）；离子源电压5.0 kV；离子源温度为 500 ℃；气帘气、雾化气和干燥气均为氮气，其中气帘气压力0.14 mPa；雾化气压力0.48 mPa，辅助气压力0.34 mPa；驻留时间为50 ms；定量测定采用多反应监测模式（MRM），其MRM条件如表1所示。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

由于灭幼脲在弱酸性环境下较稳定，试验考察了甲醇-水、甲醇-水-0.1%甲酸、甲醇-水-5 mmol/L乙酸胺的流动相体系，结果表明：甲醇-水体系色谱峰响应较低，甲醇-水-乙酸胺体系出现拖尾现象，甲醇-水-甲酸体系峰形较好，响应信号强，故本试验选择甲醇-水-0.1%甲酸体系作为流动相。

2.2 提取溶剂选择

经查阅文献，不同样品中灭幼脲采用不同溶剂进行提取，提取溶剂有乙腈-水、二氯甲烷-丙酮、二氯甲烷-石油醚、乙酸乙酯-环己烷等，不同溶剂的提取对回收率的影响不同，本试验对提取溶剂做了优化选择，具体如表2所示。可以看出几种溶剂体系回收率都比较好，但发现采用乙腈-水体系时部分样品发生乳化，二氯甲烷-丙酮体系杂质峰较多，考虑到溶剂毒性大小，选择二氯甲烷-石油醚体系提取样品中的灭幼脲。

2.3 净化条件优化

试验分别考察了氨基柱、中性氧化铝柱、酸性氧化铝柱、不过柱4种净化条件对灭幼脲回收率的影响，结果如表3 所示。可以看出，在0.1 mg/kg的添加水平下，使用小柱净化样品过程中可能造成组分流失，灭幼脲回收率偏低，因此最终选择二氯甲烷-石油醚提取，40 ℃氮气吹干后直接加入甲醇∶水（1∶1）稀释，再用正己烷脱色后直接过膜上机。

2.4 样品色谱图、标准工作曲线和检出限

在优化条件下对苹果、柑橘和梨样品分别进行检测，样品色谱图如图2所示。

分别配制成浓度为0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000 μg/mL的系列标准溶液，按上述优化条件用LC-MS/MS测定，建立标准曲线。以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标做图，每个浓度测3次，得到灭幼脲直线回归方程为y=3.98x-9.42×103，r=0.996；结果表明：灭幼脲在1～500 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，满足定量分析的需要。在样品中做加标回收，按照上述前处理方法，在同样的仪器条件下进样检测，按照3倍信噪比计算本方法的检出限为0.06 ng/mL，按照10倍信噪比计算本方法的定量限为0.2 ng/mL。

2.5 方法的精密度和回收率

取空白的苹果、柑橘和梨样品各10.0 g，分别添加灭幼脲0.01、0.05、0.10 μg/mL 3个水平，3次重复，按照上述前处理方法和仪器条件测定方法回收率，结果如表4所示。

2.6 样品贮藏期间果皮和果肉中灭幼脲残留量的变化

试验考察了常温和低温贮藏条件下3种水果样品中灭幼脲的残留变化（图3、4），结果表明，同一批经浸泡处理的水果的果皮中灭幼脲的残留量高于果肉；常温贮藏的水果样品果皮残留量随着贮藏时间增长逐渐降低，果肉中灭幼脲残留量先增加后降低；低温贮藏水果的果皮残留量高于同批制备的常温贮藏水果样品的果皮，但果肉中灭幼脲残留量均低于同批制备的常温贮藏水果样品的果肉。

3 结论

本文优化了各试验条件，建立了二氯甲烷-石油醚提取，甲醇-水稀释，正己烷脱色的LC-MS/MS方法测定苹果、柑橘和梨中灭幼脲残留，方法前处理简单，回收率和检出限均能满足分析要求。同时，研究了3种水果的果皮和果肉中灭幼脲随贮藏时间的变化规律，发现苹果、柑橘和梨在室温条件下贮藏对灭幼脲的吸收高于低温且果皮的残留水平高于果肉，为水果的贮藏和安全食用提供了参考。

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